中藥麻黃對尋常型銀屑病小鼠血清IFN-γ、IL-17的影響

李 艷，楊文信，胡榮毅，練 娜，楊春艷

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院皮膚科（瀘州 646000）；2.武漢市第一醫(yī)院皮膚科（武漢 430022）

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，在中國銀屑病發(fā)病約占0.5%，其主要特征為白色鱗片覆蓋的紅斑斑塊、皮損和劇烈瘙癢[1-2]。目前，關(guān)于銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究表明T 細(xì)胞介導(dǎo)銀屑病的發(fā)生發(fā)展，皮損中含有數(shù)量增加的炎性細(xì)胞浸潤將誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[3]，其分泌的細(xì)胞因子如IL-17、IL-22 等，參與了銀屑病的免疫發(fā)病過程，在銀屑病的致病過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[4]。T 細(xì)胞新的亞群Th17 細(xì)胞能夠分泌產(chǎn)生多種細(xì)胞因子包括IL-17、L-6、IL-21、IL-22 和TNF 等，這些細(xì)胞因子有調(diào)節(jié)和決定免疫應(yīng)答的作用，在免疫和炎癥的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。隨著外界環(huán)境的變化刺激，由樹突狀細(xì)胞分泌的IL-23分子能促進(jìn)Th17細(xì)胞增殖、活化，并產(chǎn)生IL-22，IL-17 及其他多種細(xì)胞因子[5]，因此成為銀屑病樣炎性損傷的誘發(fā)因素。

關(guān)于銀屑病的治療，皮損較輕或穩(wěn)定期的銀屑病患者主要以外用皮質(zhì)類固醇激素類、維A酸類、維生素D3衍生物類等藥物為主，嚴(yán)重患者主要以口服甲氨蝶呤（MTX）、環(huán)孢素A、阿維A、生物制劑及類固醇等藥物。但長期使用外用藥物容易引起皮膚屏障功能破壞、皮膚逐漸萎縮、毛發(fā)增多、毛細(xì)血管擴(kuò)張、誘發(fā)痤瘡、皮膚感覺異常等不良反應(yīng)；而口服藥物均存在明顯的骨髓抑制、肝功能異常和代謝紊亂等嚴(yán)重副作用，限制了其在臨床上的應(yīng)用[6]。因此，迫切需要探索新的藥物。臨床研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，在中醫(yī)辯證的基礎(chǔ)上聯(lián)合運用中藥麻黃治療本病，可“宣通玄府、辛涼宣泄”，對控制病情發(fā)展及改善預(yù)后具有重要作用[7-8]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，中藥麻黃具有抗炎、抗過敏等作用[9]，但關(guān)于其治療銀屑病的具體作用機(jī)制還尚未清晰。因此，本試驗觀察麻黃對銀屑病小鼠血清干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）的影響，以期為麻黃治療銀屑病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7～8 周齡SPF 級雄性BALB/c 小鼠60 只，體質(zhì)量20～25 g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，使用許可證號：SYXK（川）2014-189，室溫下給予標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w 后用于試驗。所有動物按照3R 原則給予人道主義關(guān)懷。（西南醫(yī)科大學(xué)動物倫理號：2021002333-040）。

1.2 藥物與試劑

甲氨蝶呤片，批號：H31020644，購自上海信誼藥業(yè)有限公司；中藥麻黃由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，中藥麻黃制備：麻黃180 g，將藥材粉碎后置于圓底燒瓶中，加入10倍量的水，浸泡8 h后煮沸，中藥麻黃提取5 h，同時安裝揮發(fā)油提取器，將藥液過濾去渣，濾液濃縮至生藥含量為1.5 g/mL，將揮發(fā)油用乙醚提取后添加聚山梨酯80 和少量濾液，攪拌至乙醚揮發(fā)后再與其余藥液混合。使用ELISA 試劑盒（上海茁彩）檢測血清IFN-γ（貨號：ZC-37905）、IL-17（貨號：ZC-37932）水平。

1.3 動物造模、分組及處理

1.3.1動物造模、分組 將60只小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、甲氨蝶呤組、中藥麻黃組，每組15只。小鼠于背部相同部位剃毛，大小約2 cm×3 cm。正常對照組：每日62.5 mg 白凡士林涂沫背部皮膚，30 min 后局部皮內(nèi)注射100 μL 生理鹽水；模型組：每日以62.5 mg咪喹莫特乳膏涂沫背部皮膚，30 min后局部皮內(nèi)注射100 μL 生理鹽水；甲氨蝶呤組：每日以62.5 mg咪喹莫特乳膏涂沫背部皮膚，30 min后給予甲氨蝶呤1 mg/kg 灌胃；中藥麻黃組：每日以62.5 mg咪喹莫特乳膏涂沫背部皮膚，30 min后給予中藥麻黃29.25 mg/kg 灌胃，連續(xù)6 d。甲氨蝶呤按藥品說明書成人日用量（每天2.5～5 mg）為基礎(chǔ)換算動物臨床等效劑量為1 mg/kg，加蒸餾水按劑量研磨配制后備用。麻黃根據(jù)《備急千金要方》和《中華人民共和國藥典》2020 年版說明（麻黃用量2～10 g），以臨床成人日用量10 g為基礎(chǔ)換算動物臨床等效劑量為29.25 mg/kg。麻黃由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，制備濃縮至生藥含量為1.5 g/mL，使用時以蒸餾水配制成所需濃度[10]。

正常對照組小鼠皮膚無鱗屑、紅斑等改變。其余各組小鼠皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑、結(jié)痂等改變，均造模成功。

1.3.2樣本采集 腹主動脈取血4 mL，3 000 r/min低溫離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存；切取小鼠背部皮損處皮膚，預(yù)冷生理鹽水迅速沖凈，于4%多聚甲醛固定。

1.4 指標(biāo)檢測及方法

1.4.1一般情況 觀察小鼠的一般情況，主要包括皮膚狀態(tài)、精神、飲食、死亡情況等。

1.4.2PASI對背部皮損進(jìn)行評估 肉眼觀察小鼠背部形態(tài)，采用銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）[11]對皮損進(jìn)行評估。即從皮損面積和皮損嚴(yán)重程度兩方面進(jìn)行綜合評分。皮損嚴(yán)重程度度評分由三個臨床體征決定（紅斑、浸潤和鱗屑），對三種體征的嚴(yán)重程度指數(shù)進(jìn)行獨立評估，評分范圍為0到4分：0表示無；1表示輕度；2表示中度；3表示嚴(yán)重；4表示非常嚴(yán)重。累積評分（紅斑+鱗屑+浸潤）顯示炎癥的嚴(yán)重程度。

1.4.3皮損組織病理學(xué)檢測 將固定的背部皮損組織石蠟包埋24 h，組織切片（3 μm）依次切割，脫脂，蘇木精-伊紅（H&E）染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察病理變化。并采集圖像，隨機(jī)選取5 個視野，對圖像進(jìn)行Baker 法評分[12]和炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)評分。Baker 法評分為：①角質(zhì)層：Munro 膿腫2 分，角化不全1 分，角化過度0.5 分；②表皮層：表皮突伸展呈棒狀0.5、1.0、1.5（輕-中-重），棘層肥厚1 分，顆粒層消失0.5分；③真皮層：炎細(xì)胞浸潤0.5、1.0、1.5（輕-中-重），乳突上伸杵狀變1分，毛細(xì)血管擴(kuò)張0.5分。

1.4.4血清中IFN-γ、IL-17 的表達(dá) 使用ELISA試劑盒（上海茁彩）檢測血清IFN-γ、IL-17 水平，試驗步驟嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常對照組小鼠皮膚無鱗屑、紅斑等改變。造模小鼠在咪喹莫特涂抹1 d后皮膚出現(xiàn)少許點狀紅斑，2～3 d 后皮膚出現(xiàn)細(xì)微鱗屑、輕度褶皺，第6 d 皮膚紅斑變?yōu)榇竺娣e深紅色，布滿層狀鱗屑、易脫落，皮膚高度增厚，隆起明顯。

2.2 組織病理學(xué)觀察

正常對照組皮膚組織表皮結(jié)構(gòu)完整清晰，角化層明顯，復(fù)層扁平上皮層較薄，細(xì)胞排列較為整齊緊密；真皮內(nèi)膠原纖維交錯排列，胞質(zhì)紅染，呈嗜酸性，毛囊與腺體形態(tài)正常，脂肪組織清晰可見；皮下肌層肌纖維排列整齊，體積大小均一，細(xì)胞核形態(tài)正常，多分布于四周。模型組角質(zhì)層角化過度，顆粒層明顯變厚，棘層肥厚，皮突明顯延長及有起伏，真皮層內(nèi)可見部分以中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，其他無明顯病變。甲氨蝶呤組角質(zhì)層角化過度，顆粒層明顯變薄，皮突稍有延長及有起伏，真皮層內(nèi)可見少量以中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，其他無明顯病變。麻黃組角質(zhì)層角化過度，真皮層內(nèi)可見少量以中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，其他無明顯病變（圖1）。

圖1 各組小鼠皮損組織病理變化（HE染色，×400）

2.3 中藥麻黃對銀屑病小鼠PASI評分及組織病理學(xué)評分的影響

結(jié)果如圖2所示，與正常對照組比較，模型組小鼠PASI 評分、Baker 評分及炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)評分明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，中藥麻黃組小鼠PASI 評分、Baker 評分及炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)評分明顯降低（P＜0.01）。與甲氨蝶呤組比較，中藥麻黃組小鼠PASI 評分、Baker 評分及炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)評分明顯降低（P＜0.01）。

圖2 中藥麻黃對銀屑病小鼠PASI評分及組織病理學(xué)評分的影響

2.4 血清中IFN-γ、IL-17的表達(dá)

結(jié)果顯示模型組小鼠血清IFN-γ、IL-17水平較空白組均明顯升高（P＜0.05），中藥麻黃治療較模型組可明顯降低IFN-γ、IL-17水平（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠血清IFN-γ、IL-17水平（pg/mL）

3 討論

銀屑病是一種臨床常見的炎癥性皮膚病。嚴(yán)重銀屑病病變可累及全身包括頭皮、指甲、粘膜、關(guān)節(jié)等部位。免疫系統(tǒng)和角質(zhì)形成細(xì)胞之間的相互作用被認(rèn)為是銀屑病主要的發(fā)病機(jī)制[13]。

銀屑病在我國古代醫(yī)籍中有“干癬”、“松皮癬”、“白疕”之稱。中醫(yī)認(rèn)為本病因素體營血虧虛，耗傷氣血，血虛生風(fēng)化燥，肌膚失養(yǎng)而成。初或者患者素體內(nèi)有蘊(yùn)熱，加之外感風(fēng)寒、風(fēng)熱之邪，阻于肌膚，蘊(yùn)結(jié)不散而發(fā)，或因性情急躁，心火內(nèi)生，或外邪入里化熱，或嗜食辛辣肥甘及葷腥發(fā)物，傷及脾胃，郁而化熱，內(nèi)外之邪相合，蘊(yùn)于血分，血熱生風(fēng)而發(fā)為本病[14]。“從血論治”的思想體系中，趙炳南、朱仁康、金起鳳認(rèn)為，血熱是促使銀屑病發(fā)生的內(nèi)在因素，強(qiáng)調(diào)“血分有熱”是發(fā)病的主因，且“血熱”的病機(jī)貫穿于銀屑病病程的始終[15]。《醫(yī)宗金鑒》曰“固有風(fēng)邪客皮膚，亦有血燥難外榮”；再如《外科大成》曰“風(fēng)毒克于肌膚，血燥不能榮養(yǎng)”。故銀屑病祖國醫(yī)學(xué)多以血熱、血癖、血燥為辨證分型，因此對于尋常型銀屑病的中醫(yī)治療上主要采用了清熱涼血、清熱解毒、養(yǎng)血潤燥、活血化瘀的藥物。然而我們在臨床中發(fā)現(xiàn)，患者發(fā)病多因受涼感冒而誘發(fā)，在進(jìn)行期時，患者皮疹色鮮紅而面積不斷擴(kuò)大，鱗屑厚而多，舌紅苔黃，脈數(shù)，血熱之癥明顯，患者同時具有咽痛，惡寒無汗，受涼病重，臨床上總結(jié)患者的發(fā)病特點及治療經(jīng)驗，在傳統(tǒng)辯證的基礎(chǔ)上加用麻黃使邪有出路，正如古籍《本草正》提出“麻黃以輕揚(yáng)之味，而兼辛溫之性，故善達(dá)肌表，走經(jīng)絡(luò)，大能表散風(fēng)邪……”，麻黃利用藥物辛散宣透疏通利的特性，開通腠理，宣暢氣機(jī)，透發(fā)血分熱邪，通暢血脈，從而達(dá)到血涼，熱透的目的。藥理發(fā)現(xiàn)中藥麻黃可通過抑制CD4+T 淋巴細(xì)胞對自身抗原的識別和應(yīng)答，使對已過激應(yīng)答的免疫系統(tǒng)得到有效控制，具有抗炎、抗過敏的作用，可用于治療銀屑病[16]。

咪喹莫特（ImQ）是一種Toll 樣受體（TLR7/8）激動劑，應(yīng)用于小鼠皮膚可誘導(dǎo)紅斑、鱗屑、棘皮病、角化不全和炎癥，ImQ 誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型和細(xì)胞模型已被廣泛用于模擬炎癥型銀屑病，這些模型有利于探索銀屑病基礎(chǔ)藥物治療的機(jī)制[17]。本研究中，模型組小鼠角質(zhì)層過度角化，顆粒層明顯變厚，皮突明顯延長及有起伏，棘層肥厚，真皮層可見炎細(xì)胞浸潤，而麻黃的使用可改善角質(zhì)層角化過度，減輕真皮層內(nèi)炎細(xì)胞浸潤。說明中藥麻黃可明顯改善小鼠皮損組織病理變化。

研究發(fā)現(xiàn)由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機(jī)制在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[18]，其中Th17 軸具有其標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17，已成為慢性疾病過程的關(guān)鍵驅(qū)動因素，并已成為藥物開發(fā)的重點，中和IL-17或阻斷其受體IL-17RA 的生物制劑，顯示出銀屑病的臨床緩解[19]。在ImQ小鼠模型中IL-17信號傳導(dǎo)在銀屑病皮炎和中性粒細(xì)胞浸潤的啟動中起關(guān)鍵作用[20]。本研究顯示中藥麻黃可減輕尋常型銀屑病小鼠皮損組織病理損傷；通過中藥麻黃治療，IFN-γ、IL-17含量較模型組均明顯降低（P＜0.05），表明中藥麻黃對IMQ 誘導(dǎo)小鼠表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)和抑制作用，這可能是其治療銀屑病的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

中藥麻黃可改善咪喹莫特誘導(dǎo)的尋常型銀屑病小鼠皮損組織病理及炎性因子變化，發(fā)揮對尋常型銀屑病小鼠的治療作用。