lncRNA與miRNA的相關性及對癌癥預后影響的meta分析

楊 清，李愛玲，王天雄，李明珂，冉浩龍，湯 艷

1.西南醫科大學公共衛生學院（瀘州 646000）；2.西南醫科大學中西醫結合學院（瀘州 646000）

據《2018年全球癌癥統計》報道，2018年有1 810萬新發癌癥病例和960萬死亡癌癥病例[1]，癌癥將成為世界上每個國家/地區死亡人數增加的首要原因和期望壽命增加最重要的障礙[2]。隨著基因組測序的發展，越來越多的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）被人類發現，包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等[3-4]。

lncRNA 是一類非蛋白質編碼的RNA 轉錄物，具有超過200 bp 的核苷酸，不具有完整的開放閱讀框，所以缺乏蛋白編碼能力[5-6]。miRNA 是一類長度為18～25個核苷酸的短的非編碼RNA，通過堿基互補配對的原則與所調控的mRNA 的3'端非翻譯區（3'UTR）發生配對，形成種子序列（5'端2～8 位核苷酸序列）[3，7-8]，在轉錄后通過抑制mRNA 翻譯或誘導mRNA 降解調控基因表達。隨著分子生物學領域的研究不斷深入，lncRNA 和miRNA 在腫瘤的發生發展過程中的相互作用越來越受到重視，兩者共同表達，能協同調控靶基因而影響癌癥的進程[9]。

到目前為止，對lncRNA 和miRNA 的相互作用進行了許多闡述，但是否存在相關性有一定爭議，而且兩者在預后及其相關性方面沒有系統的報道，因此需要對這些散在證據進行綜合與評價，以提供更有利的資料作為研究參考。此次分析主要總結了與癌癥預后有關的lncRNA 和miRNA 并分析其相關性，以評價lncRNA 和miRNA 在預后及相關性方面的現狀。

1 資料與方法

1.1 檢索策略

相關文獻通過PubMed、Embase、Web of Science、CNKI 和Cochrane 圖書館數據庫進行檢索。檢索日期：從建庫到2020 年8 月20 日。引用的相關文獻經過人工篩選，并在最終分析之前重新進行檢索。使用以下術語和關鍵詞進行檢索，英文檢索詞：“long noncoding RNA/long ncRNA/lncRNA/lincRNA/long intergenic non-coding RNA/long untranslated RNA”，“MicroRNA/miRNA/RNA，Micro or miRNA/Primary MicroRNA/pri-miRNA/stRNA/pre-miRNA”，“Neoplasms/Neoplasia/Neoplasm/Tumors/Cancer/Malignancy”；中文檢索詞：“長鏈非編碼RNA/長非編碼RNA/長鏈非編碼核糖核酸/lncRNA”，“miRNA/microRNA”，“腫 瘤/癌/Neoplasms/Neoplasia/Neoplasm/Tumors/Cancer/Malignancy”。

1.2 納入和排除標準

入選標準：①關于lncRNA-miRNA 的相關性及其與癌癥生存預后有關的前瞻性隊列研究；②原始研究人群的癌癥組織與正常組織進行量化對比，以評價lncRNA 和miRNA 的表達水平；③報道了HR及95%CI和lncRNA-miRNA 的相關系數r；④能夠獲得全文的文章。排除標準：①綜述、信件、個案報道、重復發表的研究；②缺乏可用數據，如HR 及95%CI。

1.3 文獻篩選和數據提取

根據已制定的納入和排除標準，兩位研究者獨立地篩選文獻，然后評估文獻的標題和摘要。如果從標題和摘要無法判斷文獻是否符合要求，則閱讀全文。有任何疑問則通過和第三個研究者討論解決。數據提取由兩位研究者獨立執行，有任何差異則通過小組討論解決。以下是從每篇文獻中提取的信息：①第一作者、出版年份及國家；②腫瘤類型、組織類型及樣本量；③lncRNA和miRNA的名稱；④lncRNA和miRNA 的表達水平；⑤lncRNA-miRNA 的相關系數r；⑥檢測方法；⑦隨訪時間和臨界值；⑧生存分析方法；⑨HR 及其相應的95%CI。此綜述是按PRISMA聲明編寫，注冊號為CRD42020186889[10]。

1.4 偏倚風險評估

兩位研究者獨立地完成文章的偏倚風險評估。使用紐卡斯爾-渥太華量表（the newcastle-ottawascale，NOS）對每篇文獻進行質量評價，從研究的3個方面（選擇、可比性、結果）進行評估，滿足條件則獲得一顆星（≥6顆星都是高質量）。

1.5 統計分析

使用R 4.0.2進行資料分析。合并效應量為危險比（HR）和lncRNA-miRNA 的相關系數r，風險比（HR）使用對數風險比（logHR）及其對數標準誤（SElogHR）的方法進行合并，相關系數r使用Fisher’s z變換進行效應量的合并。采用I2統計量進行異質性檢驗，I2≥50%或者P＜0.1，說明研究之間存在異質性，應采用隨機效應模型分析結果，如果沒有，則采用固定效應模型（I2＜50%或P≥0.1）。用森林圖顯示meta 分析結果，使用WHO 腫瘤分類進行亞組分析。潛在的發表偏倚使用Egger’s 檢驗進行評估，如果還存在差異則使用剪補法評價發表偏倚對結果的影響，使用敏感性分析以識別各個研究數據對HR和r匯總的影響。P＜0.05認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 文獻檢索結果

如圖1 所示，共檢索出5 587 篇研究，剔除重復后剩2 972 篇研究，根據納入排除標準篩選，并仔細閱讀題目和摘要后剩余362 篇研究，有27 篇研究符合條件，可進一步進行分析。

圖1 文獻檢索流程圖

2.2 納入文獻特征

27 篇研究共有患者2 967 例，樣本量范圍為42～248例，這些研究發表于2016年至2020年，皆來自中國。在27 篇研究中，包括乳腺癌2 篇、消化系統癌癥14 篇、頭頸部癌癥5 篇、肺癌2 篇、神經膠質瘤2篇、骨肉瘤1 篇、黑素瘤1 篇。均采用qRT-PCR 檢測lncRNA 和miRNA 的表達量，樣本皆來源于組織，生存分析的指標都是總體生存率（OS），與癌癥預后相關的lncRNA有27篇，有16篇表明了lncRNA和miRNA的相關性，HR及其95%CI和相關系數皆是直接從文獻報道的原始數據中提取。所有納入的研究紐卡斯爾-渥太華量表（NOS）評分都是≥6 顆星，主要特征見表1。

2.3 lncRNA與總體生存率之間的關聯

綜合了27篇研究，包含了2 967例癌癥患者，其結果顯示了高表達的lncRNA 與總體生存率預后不良有相關性（圖2）。由于I2=80%（P＜0.001），故使用了隨機效應模型，合并的HR為2.49（95%CI：2.04～3.03，P＜0.001）。通過亞組分析（圖3）顯示，在乳腺腫瘤、頭頸部腫瘤、消化道腫瘤（肝癌）、消化道腫瘤（胃癌、結直腸癌等）、肺癌和其他癌癥（神經膠質瘤、骨肉瘤等）中，lncRNA表達水平的升高與總生存率（OS）預后不良皆有關（HR=3.43，95%CI：1.93～6.09，P＜0.05；HR=2.73，95%CI：1.68～4.45，P＜0.05；HR=2.05，95%CI：1.43～2.95，P＜0.05；HR=2.57，95%CI：1.80～3.67，P＜0.05；HR=1.90，95%CI：1.49～2.43，P＜0.05；HR=2.59，95%CI：1.87～3.57，P＜0.05）。Egger’s 檢驗評價顯示此次分析（P＜0.05）存在發表偏倚。經剪補法檢驗后（圖4），顯示合并的HR對發表偏倚沒有明顯影響，結果穩定。敏感性分析（圖5）表明本分析是穩定和可靠的。

圖2 lncRNA表達與總體生存率的森林圖

圖3 lncRNA表達與總體生存率的亞組分析森林圖

圖4 總體生存率的發表偏倚圖

圖5 總體生存率的敏感性分析

2.4 lncRNA與miRNA之間的關聯

從16 項符合條件的研究中收集了lncRNA 與miRNA 的相關系數r，經過Fisher’sz變換進行效應量r的合并，從而得到結果（圖6）。分析發現lncRNA與miRNA呈負相關，由于I2=79%（P＜0.001），故使用隨機效應模型，合并的r值為-0.68（95%CI：-0.8～-0.56）。亞組分析（圖7）顯示，在乳腺腫瘤、消化道腫瘤（肝癌）、消化道腫瘤（胃癌、結直腸癌等）、頭頸部腫瘤、肺癌、其他癌癥（神經膠質瘤）中，lncRNA與miRNA皆呈負相關（r=-0.37，95%CI：-0.68～-0.05；r=-0.65，95%CI：-0.90～-0.39；r=-0.84，95%CI：-1～-0.62；r=-0.45，95%CI：-0.63～-0.27；r=-0.59，95%CI：-0.79～-0.40；r=-0.75，95%CI：-0.63～-0.27）。Egger’s 檢驗評估分析的發表偏倚（P=0.96），結果顯示沒有顯著的發表偏倚。敏感性分析（圖8）表明我們的分析是穩定和可靠的。

圖6 lncRNA與miRNA相關性的森林圖

圖7 lncRNA與miRNA相關性的亞組分析森林圖

圖8 相關系數的敏感性分析

3 討論

癌癥的發生發展是一個多機制且復雜的過程，lncRNA 與miRNA 在癌癥的發生發展中發揮著不可小覷的作用。研究發現lncRNA 在轉錄后和/或轉錄水平上調節基因表達，包括染色質重塑，表觀遺傳修飾，組蛋白修飾和海綿效應等[38]。lncRNA 在各種細胞過程（例如腫瘤發生以及轉移）中作為必要的調節因子出現[39]，特別是具有高度組織和發育階段特異性的表達，為癌癥的診斷和治療提供了新的可能性[40-41]。而miRNA在生物過程中起著關鍵作用，如細胞增殖、分化和凋亡等[42]。越來越多的miRNA已被證實參與促進或抑制癌癥的發生，作為癌基因或抑癌基因參與癌癥相關靶基因的表達[43-44]。且最近已有研究表明，與癌癥相關的特定lncRNA 和miRNA 可在血液和血清樣品中被檢測到[45-46]。在兩者相互作用中，有研究發現，在不同癌癥組織及細胞中，不同類型的lncRNA表達升高，相應的miRNA 表達下調，從而進一步影響癌癥的進展。比如lncRNA可以通過競爭性結合miRNA，抑制miRNA表達及其對下游靶基因的負向調控作用，能抑制腫瘤增值、侵襲、遷移和促進腫瘤細胞凋亡，這無疑為癌癥治療提供了新思路和方向[47]。因此對lncRNA和miRNA之間機制的深入研究，可能為未來癌癥診斷、預后甚至是治療找到新的突破口[48]。

本次meta 分析主要是在探索lncRNA 與miRNA對癌癥預后的影響以及它們之間的相關性。本文評價了研究中的lncRNA 和miRNA，其中大部分都只被研究過一次，可提供有關lncRNA 與miRNA 對癌癥預后及其相關性的部分見解。

本研究分析表明，高表達的lncRNA是總體生存率預后不良的危險因素。在亞組分析中，相對于其他癌癥來說，乳腺腫瘤、頭頸部腫瘤中的lncRNA 表達水平的升高對OS 預后不良表現的更為顯著。此外，有的文章顯示了HR 作為危險因素的證據相對不足，如Cui C[33]研究表明HR 的可信區間為1.02～2.08，但經過合并后，總體HR的準確度升高，顯示了lncRNA 可能是預后差的危險因素，且研究發現，lncRNA作為乳腺腫瘤（HR=3.43）預后不良的危險因素比肺癌（HR=1.90）的證據更強。這些研究皆是調查的lncRNA 與OS 之間的關系，且大多數都采用的是多因素分析，大多數結果都顯示了lncRNA與癌癥的總體生存率之間存在著統計學上的相關性，揭示了lncRNA在癌癥預后中具有一定的價值，可能作為癌癥預后的獨立預測因子，并在不同腫瘤類型中得到了體現，可以更有針對性的開展研究。

在lncRNA 與miRNA 的相關分析中，發現lncRNA與miRNA的表達主要呈負相關，且合并的r表現為強相關。其中在消化道腫瘤和神經膠質瘤表現的相關性皆比其他腫瘤都要強，在乳腺腫瘤表現的相關性最弱。雖然有的文章顯示了lncRNA 和miRNA之間無相關性，如Yan G[17]研究表明，二者的相關系數r可信區間為-0.57～0.03，但合并后，總體上表現是有相關性的。通過此次分析發現相關性強弱不一，說明需要更多高質量的研究去驗證這種影響對哪一類的腫瘤影響更大。目前這些研究說明了lncRNA 與miRNA 在統計學上存在相關性，顯示了lncRNA 和miRNA 之間存在相互作用，并且可能影響癌癥的發生發展。

此次研究存在一定的異質性，但通過敏感性分析發現，總的結果穩定性還可以接受。此次研究也存在一定的不足，第一，納入研究的人群主要在中國，因此對其他國家在這方面的影響不了解；第二，對于lncRNA 與miRNA 相互作用的研究還處于初步的探索階段，因此在不同癌癥、不同樣本量的選擇、方法學的確定等方面存在差異；第三，50%的研究樣本量比較小（＜100），而小樣本量研究被認為與更高的異質性有關[49]；第四，由于研究之間存在異質性，使得納入部分可能造成對合并結果可信度的影響，因此今后還需要更多的針對癌癥的前瞻性隊列研究加以驗證。

4 結論

本次meta 分析總結了與癌癥預后有關的lncRNA 和miRNA 并分析了它們之間的相關性，說明非編碼RNA對于癌癥預后來說可能是預測因子，且lncRNA 與miRNA 之間存在相關性，可能共同發揮作用影響癌癥預后，或許可以為下一步抗腫瘤研究提供新的方向，但尚待更多高質量的研究加以驗證。