基于質譜技術的膽汁酸代謝組學在肝膽疾病中的應用

金鑫蕊，古秀娟，伍 煜，田 剛，劉靳波

西南醫科大學附屬醫院醫學檢驗部（瀘州 646000）

膽汁酸是肝臟中膽固醇分解代謝的最終產物，作為膽汁的活性成分從肝臟分泌到腸腔中，對膳食脂肪、藥物和脂溶性維生素在腸道中的乳化以及隨后的吸收和運輸起著重要作用[1]。此外，膽汁酸可以作為信號分子和代謝調節劑，通過激活核受體法尼基衍生物X 受體（farnesoid X receptor，FXR）和G 蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor，TGR5），以調節宿主脂質、葡萄糖和膽固醇穩態[2-4]。作為人體內源性的代謝物，膽汁酸種類繁多，由于其側鏈的結構、立體化學性質以及羥基的數量和位置等不同，表現出多樣化甚至相反的生化和生理特性[5]。例如，膽酸（cholic acid，CA）促進腸道膽固醇吸附，而鵝去氧膽酸（chenodexycholic acid，CDCA）抑制腸道膽固醇吸附[6]；石膽酸（lithocholic acid，LCA）和去氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）被認為是潛在的致癌因子，而熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）具有一定的抑制癌癥作用[7]。不同種類的膽汁酸對疾病的作用差異較大，而目前臨床上僅通過檢測人血清總膽汁酸水平來診斷相關疾病，由于其靈敏度和特異性較差容易造成漏診、誤診[8]。因此，通過全面、準確的監測不同生物樣品中各種類型膽汁酸含量，有助于探索疾病診療和預后的新策略。

代謝組學是一個新興的組學技術領域，可以揭示外源性刺激或生物系統基因突變后體液或組織中小分子代謝物的整體變化，用于疾病的早期診斷和治療監測[9]。隨著分析儀器的快速發展，基于質譜（mass spectrometry，MS）檢測技術的膽汁酸代謝組學分析能夠完全、準確地監測其類型和內容，使得膽汁酸代謝組學在肝膽疾病研究中得到廣泛應用[10]。因此，本文將重點綜述近年來基于質譜技術的膽汁酸代謝組學分析以及其在探索肝膽疾病分子標志物中的研究進展，為常見肝膽疾病診斷、治療提供新思路。

1 質譜技術

MS 技術具有特異性強、分辨率高、靈敏度高等優點，對于生物體液或組織樣本，在一次檢測分析中，能同時覆蓋成百上千種小分子代謝物特征[11]。其鑒定手段主要基于將樣品轉化為運動的氣態離子后，各種帶電離子將按照各自特定的質荷比（m/z）進行分離，然后在施加電場或磁場的高真空質量分析器中形成各自不同的運動軌跡，并通過數據記錄和轉換產生最終的質譜圖[12]。質譜儀一般由進樣系統、離子源、質量分析儀、離子檢測器和數據處理系統五個部分組成（圖1）。目前，最常見的離子源是電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）和基質輔助激光解吸離子化（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI）離子源，前者的電離是通過在大氣壓下對液滴施加高電壓來發生的，通常與三重四級桿、四極桿或離子阱質量分析器耦合；而MALDI是通過脈沖激光束使分子升華而發生電離的，常與飛行時間質譜耦合。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）用于識別大型生物分子，如蛋白質、肽、核酸和聚合物[13]。然而，由于生物樣品成分太過復雜，基于MS 的代謝組學研究通常需要結合互補分離技術使用，如氣相色譜（Gas chromatography，GC）或液相色譜（Liquid chromatography，LC）。ESI-MS 與色譜聯用的分析平臺已證明在膽汁酸代謝組學中是有效的，可用于相對復雜樣品的分析[14]。

圖1 MS的示意圖

2 代謝組學分析方法

由于代謝組學研究通常包含數百到數千個變量，多元統計方法被用于減少和可視化復雜的數據集，如主成分分析（PCA）、部分最小二乘法判別分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）和二元邏輯回歸。PCA是一種無監督的統計方法，它降低了高維數據的維度，根據代謝物數據集模式在主成分圖上（PC）可視化樣本分布和分組，因此被大多數代謝組學研究作為數據分析的第一步[15]。但PCA只有當組內變異遠遠小于組間變異時才顯示組分離，因此需要進一步使用PLS-DA、OPLS-DA等監督方法來增強分類性能[16-17]。然而，由于分析的代謝物數量通常遠大于樣本量，監督模型可能會過度擬合數據信息，需要通過內部交叉驗證和排列方法進行驗證。這種過擬合問題可以通過刪除無用信息來避免，即通過選擇與類別成員最相關的變量或制定更好的患者分層策略。此外，邏輯回歸是另一種廣泛使用的基于邏輯函數的回歸分析方法，在生物醫學問題中也被廣泛應用于預測和分類[18]。

3 基于質譜技術的膽汁酸代謝組學在肝膽疾病中的應用

肝、膽囊和腸共同參與維持人體膽汁酸平衡，在正常狀態下只有少量膽汁酸進入血液循環。肝臟或膽道疾病可引起膽汁酸的代謝紊亂，導致血清膽汁酸的成分和含量發生顯著變化[19-20]。目前，許多學者利用質譜技術對生物樣品中的膽汁酸代謝特征進行了相關實驗研究，為肝膽疾病的診斷提供了新方法。

3.1 在妊娠期肝內膽汁淤積癥中的應用

妊娠期肝內膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）孕婦具有獨特的血清膽汁酸代謝特征，HPLC-MS結果顯示在未經治療的女性中，CA是主要的膽汁酸（51%），并且UDCA 濃度＜0.5%，而UDCA占治療后血清膽汁酸的60%，CA降至＜20%[21]。UDCA作為目前治療ICP的一線藥物，能顯著減輕患者瘙癢癥狀，改善肝功能指標，同時降低不良的母嬰結局發生率[22]。CA已被證明可以誘導子宮肌層催產素受體的表達，并在注入綿羊體內時可誘導早產[23]。此外，在嚙齒類動物和人類胎心體外模型的培養基中添加CA可導致心律失常，這可能是導致胎兒致命的心律失常的原因[24-26]。因此，ICP 與胎兒并發癥之間的關聯增加了對膽汁酸濃度監測的關注。例如，通過超高效液相色譜-三重四級桿-飛行時間質譜（UPLC-TripleTOF-MS/MS）方法對50 例正常孕婦、51例ICP孕婦、14 例早期ICP孕婦和21例妊娠肝功能紊亂孕婦血清中的56種膽汁酸成分進行分析，發現早期ICP 孕婦的膽汁酸濃度與正常妊娠孕婦相比，牛磺膽酸（taurocholic acid，TCA）、甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA）、甘氨結合型三羥基膽汁酸-3（Gtri-3）、甘氨結合型三羥基膽汁酸-5（Gtri-5）顯著升高；采用PLS-DA建立的聯合診斷模型對ICP的早期診斷具有較高效能，靈敏度為85.7%，特異度為95.2%，AUC 為0.966[27]。Zhu 等[28]通過LC-MS 方法分析了290 例妊娠中期（12～28 周）和492 例妊娠晚期（29～40 周）ICP 患者的14 種膽汁酸濃度，發現總膽汁酸濃度保持穩定，但膽汁酸個體變化不同；未結合的膽汁酸（CA，CDCA、LCA、DCA）在28 周前占主導地位，而結合膽汁酸濃度在31 周之后增加；胎齡28～31 周是膽汁酸代謝的顯著變化期。趙等[8]發現ICP 患者血清中牛磺脫氧膽酸（taurogoose deoxycholic acid，TDCA）濃度是妊娠期內高膽汁酸血癥（hyperbilirubinemia during pregnancy，AHP）孕婦的2倍，AHP 孕婦的DCA 和甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA）濃度分別較ICP孕婦高出2.72倍和3.22倍，以上三種膽汁酸可作為AHP 與ICP 鑒別診斷的潛在生物標記物。

除了血清，尿液中膽汁酸代謝譜也可用于ICP的鑒別。尿液中70%～80%的膽汁酸通過硫酸化結合，硫酸化是膽汁酸排泄的重要代謝途徑[29]。OPLS-DA 結果顯示七種硫酸化膽汁酸包括硫酸化二羥基甘氨酸膽汁酸（di-GBA-S）、甘氨酸膽酸-3-硫酸鹽（GCA-3S）、硫酸化二羥基牛磺酸膽汁酸（di-TBA-S-3、di-TBA-S-2）、牛磺酸膽酸-3-硫酸鹽（TCA-3S）、牛磺石膽酸-3-硫酸鹽（TLCA-3S）和膽酸-3-硫酸鹽（CA-3S）。在投影（VIP）值中變量重要性大于1，可能是區分ICP孕婦和正常孕婦的潛在生物標志物[30]。在另外一項研究中，Chen等[12]開發了一種基于UPLC-QTOF-MS平臺的偽靶向方法，用于測定隨機尿液靶向和非靶向膽汁酸代謝譜，結果顯示mono-S、Gtri-S-2 聯合TLCA-S 是AHP 和ICP 鑒別診斷的潛在組合生物標志物（AUC為0.990）。

3.2 在非酒精性脂肪性肝病中的應用

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種慢性進行性肝病，涵蓋一系列肝損傷，包括脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、纖維化和肝硬化[31]。NAFLD 中肝臟膽汁酸代謝和轉運蛋白的變化可能會改變主要的膽汁酸種類，從而影響餐后膽汁酸依賴性信號傳導和調節肝臟炎癥級聯反應[32-34]。通過對NAFLD患者膽汁酸種類進行檢測，發現糞便中排出的次級膽汁酸減少，血清中甘氨酸和牛磺酸結合的膽汁酸增加[35]。近期有研究[28]采用穩定同位素稀釋的LC/MS/MS 靶向代謝組學方法來探索膽汁酸多組分與NAFLD 組織病理學指標（肝細胞纖維化、晚期脂肪變性、氣球樣變和炎癥）的關聯，以及它們與NAFLD和NASH相關遺傳變異的關聯。結果顯示，血漿次級膽汁酸7-Keto-DCA 和7-Keto-LCA 的劑量水平與氣球樣變和NASH 相關，而初級膽汁酸的水平與炎癥和纖維化相關。幾個NAFLD/NASH位點的基因變異與7-酮和甘氨酸結合形式的膽汁酸水平升高相關，而TRIB1位點的NAFLD風險等位基因表現出血漿GCA 和糖醛脫氧膽酸（GUDCA）水平升高的強烈趨勢。此外，Caussy 等[36]也報道了NAFLD 和NASH 患者的血清膽汁酸成分隨著肝纖維化階段（F0-F4）的演變而顯著變化。一般來說，更疏水的膽汁酸種類（如未結合的次級膽汁酸）具有更大的細胞毒性作用[37]。通過采用LC-MS 方法分別檢測在空腹條件下和標準化餐后的15 名健康志愿者和7 名NASH 患者的30 種血清膽汁酸和16 種尿膽汁酸代謝變化，結果顯示NASH 患者的空腹和餐后膽汁酸譜表現出更大的變異性，其接觸疏水和細胞毒性更強的次級膽汁酸幾率更高，所以膽汁酸暴露量的增加可能與肝損傷以及NAFLD 和NASH 的發病機制有關[38]。

此外，中藥研究者們也從膽汁酸代謝組學分析的角度出發，將其應用于中藥療效的評價。例如，采用UPLC-MS/MS檢測非酒精性脂肪性肝炎相關肝細胞癌（NASH-HCC）小鼠模型中多種膽汁酸代謝產物含量，發現白藜蘆醇（RSV）干預后DCA、GCA、TCA、牛磺β鼠膽酸（TβMCA）、牛磺鵝去氧膽酸（TCDCA）、CDCA、CA、TLCA 等多種致癌膽汁酸組分水平顯著下降，模型小鼠肝癌早期脂肪變、炎癥損傷及纖維化程度明顯改善。RSV調控膽汁酸代謝譜，激活膽汁酸受體，促進膽汁酸在肝內的排泄，從而減少HCC 發病率[39]。Han等[40]研究了龍膽苦苷（GPS）對小鼠血液、肝臟、尿液中73種小分子物質和84種蛋白質代謝情況的影響，從而探討其對萘基硫氰酸酯（ANIT）誘導膽汁淤積性肝損傷的作用和機制。結果發現，與對照組相比，TCA、GCA、TCDCA 和甘氨鵝去氧膽酸（GCDCA）在ANIT 組中顯著上調，但GPS 可以顯著降低血清、尿液和肝臟中這些代謝物的水平，并減輕肝損傷。

3.3 在肝細胞癌中的應用

肝細胞癌（hepatocellur carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌，占這類惡性腫瘤的80%～90%[41]。研究發現CDCA、DCA、LCA 等膽汁酸成分可對肝星狀細胞（HSCs）內NLRP3 炎性小體的活性產生雙向調節，從而影響HCC形成[42]。近期研究[43]也發現DCA可導致LX2的細胞衰老，通過G0/1期的細胞周期阻斷導致細胞生長抑制，并伴有DNA損傷和細胞周期停滯。衰老HSCs分泌的與衰老相關的分泌表型因子（SASP）積極誘導細胞遷移和HCC 細胞入侵，而TGFβ或IL8 的信號阻斷顯著抑制了HCC 細胞的遷移和入侵，這表明對TGFβ和IL8的干預可能成為一種新的治療策略。此外，王等[44]應用UPLC-QTOF-MS/MS技術對50例肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者和50例HCC患者的血清進行了代謝組學研究，鑒定出了19 種膽汁酸相關代謝物，其中變化最顯著的是GCA，在RPLC-POS、RPLC-NEG 和HILIC-NEG 3 種檢測模式下均檢測出變化且變化倍數一致，VIP 值分別為8.0，16.0 和33.0。另外2 個差異顯著的膽汁酸代謝物2-脫氧栗甾酮和脫氧膽酸甘氨酸偶聯物，VIP 值均為8.9。VIP 值越大，表示對LC 和HCC 區分的貢獻值越大，所以這3 個代謝物可以作為區分HCC和LC患者的潛在標志物。張等[45]應用LC-MS技術對24 例HCC、15 例LC、6 例慢性乙肝（HBV）患者及12 例健康對照者（HC）血漿膽汁酸組分進行了比較研究，結果顯示HCC組中CA、CDCA、TDCA、LCA、GCDCA 及GDCA 的濃度明顯高于HBV-LC 組與HC組，其中LCA 濃度與HCC 進展呈正相關，有可能成為HCC 發生進展的評價指標。此外，采用非靶向代謝組學方法檢測262 例HCC 患者、76 例LC 患者和74 例HBV 患者的血清，結果顯示由TCA、溶血磷乙醇胺和溶血磷酰膽堿組成的聯合標記物對鑒別小肝腫瘤（直徑小于2cm 的單獨結節）有效，敏感性為80.5%，特異性為80.1%。而且，它們對鑒別HCC和慢性肝病患者也有效，可獲得87.5%的敏感性和72.3%的特異性，研究結果為這些代謝物被用作HCC和慢性肝病分類的標記物提供了初步證據[46]。

3.4 在膽道系統疾病中的應用

原發性硬化性膽管炎（Primary sclerosing cholangitis，PSC）是一種慢性膽汁淤積性肝病，其特征是肝內和肝外膽管的持續炎癥、破壞和纖維化。目前，PSC 與原發性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）的鑒別診斷有時由于臨床、血清學、組織學和放射學發現重疊而更加復雜。Bell 等[47]使用UHPLC-MS-MS-MS、UHPLC-MS-MS、GC-MS 三個獨立質譜平臺檢測了18例PBC患者、21例PSC患者和10例健康對照者的血清代謝物，并識別可能區分這兩種膽汁淤積性疾病的代謝物。在PBC 和PSC 組中都觀察到未結合、結合和硫酸化膽汁酸的升高，而來自腸道微生物繼發性膽汁酸有微小變化；其中有一項特別有趣的發現，PBC患者與PSC患者相比，血清氫酸鹽明顯升高，這是一種不尋常的由CDCA 合成的三羥基膽汁酸。這種變化與Trottier 等[48]的研究結果基本一致，證明PBC 和PSC 的病理學特點是主要影響原發性膽汁酸。此外，研究發現氫酸鹽在患有拜勒病的成人[49]和兒童[50]的尿液中升高，因此可作為膽汁淤積和肝臟將膽汁酸代謝為其分泌形式能力的生物標志物。

目前將膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）與良性膽道疾病（benign biliary disease，BBD）區分開來是一個挑戰。Song 等[51]分析了與CCA 細胞系中CCA 發育相關的膽汁酸受體的基因表達，發現在用GCA處理的CCA 細胞中，TGR5 和蛋白苷1-磷酸受體2（S1PR2）的基因表達比對照組（不用膽汁酸處理）分別高出8.6 倍和3.4 倍。在TCDCA 處理的細胞中，TGR5和S1PR2的基因表達與對照組并無顯著差異，說明GCA和TCDCA可作為CCA的表型特異性生物標志物。其他研究小組報告顯示，CCA 患者中CA 和CDCA 的 比 例 高 于BBD 或HCC 患 者[33]。利 用UPLC-MS/MS 測量329 名受試者包括BBD、CCA、膽囊癌（gallbladder carcinoma，GC）患者、HCC 患者和健康受試者血漿中15 種膽汁酸濃度，發現由CDCA和TCDCA 組成的聯合標志物分別對CCA 與BBD、CCA 與HC 顯示出較高的診斷性能，具有比糖類抗原19-9（CA 199）更高的AUC、敏感性和特異性[52]。

關于藥物療效評價方面，考來維侖增加了硬化性膽管炎Mdr2-/-小鼠模型中糞便膽汁酸的排泄，可以逆轉膽汁性肝和膽管損傷，肝和膽汁中的膽汁酸組分更多地顯示出向親水性次級膽汁酸轉化[53]。此外，采用LC-MS 方法對13 例健康對照者，292 例膽囊結石和25 例非腫瘤息肉患者血漿中14 種代謝物進行比較，發現在膽囊疾病組（gallbladder disease，GBD）中UDCA、尿脫氧膽酸（TUDCA）、糖苷脫氧膽酸（GUDCA）、TCDCA 和GCDCA 顯著降低，UDCA 與白細胞計數和中性粒細胞百分比呈負相關。GBD 患者血液中白細胞數量的異常增加，尤其是中性粒細胞的積累，提示誘導的炎癥損傷可能導致炎癥性膽囊息肉。UDCA是治療GBD很有吸引力的候選藥物，因為它可能會影響腸道微生物群落結構[54]。

4 結語

眾所周知，膽汁酸是重要的信號分子，在調節脂質、葡萄糖和能量代謝方面起著重要作用。在肝膽疾病患者中，肝臟合成、代謝和清除以及腸道吸收的紊亂會影響膽汁酸在不同部位（血漿、肝臟、膽囊、尿液和糞便）中的濃度和分布。近年來，隨著質譜技術和軟件算法的發展，質譜與各種分離技術結合尋找肝膽疾病生物標志物的研究層出不窮。目前，質譜分析廣泛應用于ICP、HCC 和PSC 等肝膽疾病的膽汁酸代謝組學研究，可分析多種類型的組織樣本，其研究成果為常見肝膽疾病的精準診療提供新的理論依據，將成為今后研究的熱點。