丹參酮ⅡA通過調控NF-κB信號通路對膿毒癥大鼠血管內皮細胞的保護作用

劉旭東,馮俊,周代星,于剛

膿毒癥是機體對感染反應失調導致的危及生命的器官功能障礙疾病[1]。有研究表明，膿毒癥患者病死率高達30%～50%[2]。臨床上對于膿毒癥的治療，主要采取早期抗感染治療、液體復蘇、血管活性藥物應用及器官支持等手段[3-4]。近年來的研究表明，血管內皮細胞(VEC)功能障礙在膿毒癥進展中處于樞紐地位[5]。膿毒癥早期，內毒素作用于血管內皮細胞表面的受體，促進炎性因子大量釋放，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)等。內毒素及炎性因子的大量釋放，直接損傷血管內皮細胞，使其通透性增加，導致毛細血管滲漏，加重組織器官灌注不足，進而導致多器官功能障礙[6-9]。因此，改善血管內皮細胞功能對降低膿毒癥的病死率至關重要，也為臨床治療膿毒癥提供了新的治療思路[10-11]。丹參酮ⅡA 是中藥丹參中最主要的生物活性成分之一，已有研究表明其通過保護內皮細胞對多種心血管疾病具有保護作用[12-13]，但目前對其是否可改善膿毒癥的內皮細胞損傷還不清楚。 因此，本研究旨在觀察丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠血管內皮細胞的保護作用，并探討可能機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)動物： 雄性SD大鼠36只，月齡9周，體質量 280～300 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，飼養于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。本次動物實驗符合動物倫理委員會的要求，并嚴格按照《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《實驗動物質量管理方法》的要求進行。(2)藥品與試劑：丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(諾新康，上海第一生化藥業有限公司生產)；NF-κB激活—核轉運檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司生產)；ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產)；TUNEL檢測試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司生產)。(3) 儀器設備： 熒光顯微鏡(UFM3201型，深圳盛天儀器有限公司生產)；冰箱(BL-200SM200L型，南京中大天晴儀器有限公司生產)；電泳儀(EPS-300型，上海天能科技有限公司生產)。

1.2 實驗方法 實驗于2019年1—12月在華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院進行。(1) 分組：健康雄性SD大鼠36只隨機數字表法分為假手術+生理鹽水(NS)組(對照組)，盲腸結扎穿孔術(CLP)+NS組(膿毒癥組)，CLP+丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液組(丹參酮ⅡA干預組)，每組12只。(2)模型制備：大鼠術前禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg),充分麻醉后置于仰臥位并固定,消毒腹部皮膚,于中下腹部做縱切口3 cm,打開腹腔,鈍性分離及游離以充分暴露盲腸，膿毒癥組和丹參酮ⅡA干預組于距盲腸末端 1 cm處采用3號縫合線環形結扎,保證腸道通暢,并據結扎處5 mm位置采用9號針頭貫穿盲腸2次，并輕擠壓確保糞便溢出，并進行后續的關閉腹腔手術；對照組僅做盲腸探查術。丹參酮ⅡA干預組術前2 h通過尾靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(20 mg/kg)，對照組及膿毒癥組術前2 h通過尾靜脈注射同等量的0.9%氯化鈉注射液。(3)標本收集與保存：造模24 h后，頸椎脫臼處死大鼠，取大鼠外周血管組織，采用4%中性甲醛固定外周血管組織，24 h后采用梯度酒精脫水處理，對外周血管組織進行石蠟包埋后切成5 μm 的病理組織切片，取外周血管組織立刻放入液氮罐冷凍后-80℃冰箱保存待測。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血管內皮細胞NF-κB表達檢測： 先取外周血管病理組織切片進行常規脫蠟及水化處理，然后根據NF-κB激活—核轉運檢測試劑盒的使用說明書，并參照Linghu等[4]使用的方法對組織切片進行免疫熒光染色，用熒光顯微鏡觀察染色情況。本試劑盒染色后NF-κB呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。

1.3.2 血管內皮細胞凋亡及促凋亡基因 Caspase-3蛋白水平檢測：(1)細胞凋亡檢測，采用原位缺口末端標記法(TUNEL法)，具體操作嚴格按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。凋亡細胞核被染成棕黃色，未凋亡細胞核為深藍色。(2) 促凋亡基因 Caspase-3的蛋白水平檢測，采用Western-blot法，具體步驟見文獻[5]的報道，將提取好的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸后，進行10%SDS-PAGE電泳，采用半干轉進行蛋白轉膜，根據要求加入Caspase-3的抗孵育過夜，待完成二抗孵育后進行ECL顯示處理，將數據進行Gel-Pro analyzer分析光密度， 最終結果以Caspase-3和 β-actin 的光密度比值表示。

2 結 果

2.1 各組大鼠血管內皮細胞NF-κB表達比較 采用免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下NF-κB呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。血管內皮細胞漿及細胞核內出現紅色顆粒染色即為表達NF-κB，正常血管內皮細胞(對照組)幾乎不或弱表達NF-κB。與對照組(1.32±0.56)比較，膿毒癥組(43.25±4.33)血管內皮細胞漿和細胞核均顯示不同程度的紅色顆粒染色，且血管內皮細胞中NF-κB平均光密度值均明顯高于對照組(t/P=213.158/0.000)；而丹參酮ⅡA干預組(20.74±5.28)NF-κB平均光密度值明顯低于膿毒癥組(t/P=116.995/0.000)，見圖1。

圖1 各組大鼠血管內皮細胞NF-κB表達比較(HE染色，×100)

2.2 各組大鼠血管內皮細胞凋亡比較 熒光顯微鏡下觀察，對照組細胞核呈圓形或橢圓形，熒光分布均勻。與對照組比較，膿毒癥組內皮細胞出現典型的細胞凋亡形態，胞核固縮，致密深染，染色質邊集，細胞質內可見亮藍色強熒光；與膿毒癥組比較，丹參酮ⅡA干預組細胞凋亡程度減輕，見圖2。

圖2 各組大鼠血管內皮細胞凋亡情況比較

2.3 各組大鼠血管內皮細胞Caspase-3凋亡蛋白表達比較 與對照組(0.25±0.01)比較，膿毒癥組血管內皮細胞Caspase-3表達水平(0.57±0.05)明顯增加(t/P=20.086/0.000)；與膿毒癥組比較，丹參酮ⅡA干預組血管內皮細胞Caspase-3表達水平(0.30±0.25)明顯降低(t/P=24.576/0.000)。

3 討 論

膿毒癥是一種臨床綜合征，定義為對感染的全身反應，其特征是器官功能障礙和休克[1]。膿毒癥和隨后出現的多器官功能衰竭仍然是重癥監護病房發病和死亡的主要原因。膿毒癥時，血管內皮是病原體及其毒素的關鍵宿主靶點，血液中的脂多糖(LPS)及大量炎性因子刺激血管內皮細胞，導致內皮細胞損傷[6]。膿毒癥導致的內皮細胞損傷可具體表現為：引起內皮細胞通透性增加，導致血管滲漏，周圍組織水腫，局部組織器官循環不足，進而導致器官功能障礙[7]。有研究表明，LPS可誘導內皮細胞程序性死亡(凋亡)，抑制內皮細胞的凋亡可改善內皮細胞損傷[8]。本研究結果顯示，膿毒癥組內皮細胞出現典型的細胞凋亡形態，且膿毒癥組血管內皮細胞Caspase-3等凋亡蛋白表達水平增高，提示膿毒癥可誘導內皮細胞凋亡。本研究結果與多項動物實驗結果類似[9-11]。

丹參酮ⅡA是中藥丹參的脂溶性有效成分,因其特殊的藥理作用，包括舒張血管、抗凝、抗炎、清除自由基等，在我國被廣泛用于治療與循環系統紊亂有關的疾病[12]。動物實驗表明，丹參酮對膿毒癥大鼠小腸具有保護作用，其機制可能與抑制腸上皮細胞凋亡和減少炎性細胞因子的活化有關[13]。本研究結果顯示，丹參酮ⅡA干預組細胞凋亡程度減輕，且血管內皮細胞Caspase-3凋亡蛋白表達水平降低，提示丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠血管內皮細胞起到保護作用，其機制可能與丹參酮可抑制內皮細胞凋亡有關。

核因子-κB參與許多免疫調節介質的轉錄，這些免疫調節介質參與了膿毒癥誘導的器官衰竭發展[14]。在膿毒癥模型中，抑制NF-κB的激活可以減少急性炎性反應過程和器官功能障礙。Huang等[15]實驗研究表明，抑制NF-κB信號通路可以保護肺微血管內皮細胞免受LPS誘導的凋亡；Kurpios-Piec等[16]的研究也表明，激活NF-κB可促進炎性反應，并引起內皮細胞的損傷。由此可見，NF-κB相關因子極可能介導了炎性反應誘導的內皮細胞損害，減少NF-κB信號通路的激活對血管內皮細胞的保護至關重要。本研究發現，膿毒癥大鼠血管內皮細胞NF-κB平均光密度值明顯升高，而丹參酮ⅡA處理后NF-κB平均光密度值明顯降低。上述結果表明，膿毒癥可激活NF-κB信號通路，誘導內皮細胞凋亡，并進一步引起內皮細胞損傷；而丹參酮ⅡA干預后可抑制NF-κB信號通路的激活，起到保護內皮細胞的作用。

綜上所述,丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠血管內皮細胞具有保護作用，這可能與抑制NF-κB信號傳導通路進而抑制內皮細胞凋亡有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉旭東：實施研究過程及論文撰寫；馮俊、周代星：實驗指導，論文修改及論文審核；于剛：提出研究思路，設計研究方案，分析實驗數據