ROS/SRC/FAK信號通路在膀胱癌疾病進展中的作用機制研究

羅華榮，王天如，陳晨，黃盛松，卞崔冬，孫祖俊，吳登龍

膀胱癌屬泌尿系統最常見惡性腫瘤，手術切除是目前首選治療方法，但部分腫瘤會發生浸潤或轉移，且經過化療后易造成化療耐藥性，因此，影響治療效果[1]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)可損壞細胞、抑制腫瘤細胞活性，促進腫瘤細胞死亡，且已驗證在膀胱癌中發揮作用[2]。類固醇受體共激活因子(steroid receptor coactivator，SRC)/黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)信號通路激活后會形成一個雙重的激酶復合物，進而促進細胞運動、細胞生長，在癌細胞中促進細胞生長、增殖和遷移過程[3]。隨著研究的深入，發現ROS可作用于SRC/FAK信號通路從而影響相關腫瘤疾病進展，影響病情[4]。因此，現分析癌組織的臨床病理因素，并以膀胱癌T24細胞為研究對象，驗證誘發膀胱癌疾病進展的原因，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 癌組織及細胞：收集2019年6月—2020年12月同濟大學附屬同濟醫院泌尿外科經膀胱鏡活檢、膀胱部分切除的膀胱癌組織標本69份，同時取癌旁組織作為對照。腫瘤病理分級(histopathological grading，簡稱G)根據世界衛生組織分類標準[5]，臨床分期(tumor node metastasis staging，TNM，簡稱T)根據國際抗癌聯盟分期標準[6]，為便于分析，將G1和G2歸為分化較好，G3和G4歸為分化較差；T0和T1歸為非浸潤性，T2、T3、T4歸為浸潤性；其中分化較好59份，分化較差10份；浸潤性34份，非浸潤性35份。本研究經醫院倫理委員會審核批準(審批號：2019-TYH-051)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

膀胱癌T24細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，批號 SCSP-536。

1.1.2 試劑與儀器：ROS清除劑N,N'-二甲基硫脲(DMTU，美國Biochem公司生產)；SRC激酶抑制劑(PP2，美國Sigma公司生產)；RPMI1640培養液、BCA試劑盒、DAB顯色試劑、ROS檢測試劑盒(江蘇凱基生物科技發展有限公司生產)；兔抗人SRC一抗、磷酸化SRC(phosphorylation-SRC，p-SRC)一抗、FAK一抗、磷酸化FAK(phosphorylation-FAK，p-FAK)一抗、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)一抗、鈣蛋白酶2(calcium-activated neutral protease 2，calpain2)一抗、GAPDH一抗、兔抗人二抗(英國Abcam公司生產)。顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司，型號 XDS-800C)；CO2培養箱(杭州聚同電子有限公司，型號 CHP-01)；蛋白凝膠成像儀(上海Tanton公司，型號 5200)。

1.2 膀胱癌T24細胞處理及分組 膀胱癌T24細胞在含10%胎牛血清RPMI1640培養液(添加青霉素、鏈霉素各1 000 IU/L，完全培養液)中培養，置于5%CO2、37℃培養箱，待細胞密度達90%進行實驗。實驗細胞分為對照組、DMTU干預組、DMTU+PP2干預組。1×105個/孔細胞置于6孔板中，待細胞密度達80%時，各組細胞更換無血清培養液培養24 h。對照組更換為完全培養液繼續培養；DMTU干預組用完全培養液稀釋DMTU濃度20 μmol/L處理30 min，再更換為完全培養液培養；DMTU+PP2干預組用完全培養液稀釋DMTU濃度20 μmol/L和PP2濃度5 μmol/L共同處理30 min，再更換為完全培養液培養。各組細胞繼續培養24 h進行后續實驗。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 免疫組化檢測膀胱癌組織、癌旁組織中SRC、FAK陽性表達：病理組織常規切片后，孵育SRC、FAK一抗，正常兔血清代替一抗作為陰性對照。由2位經驗豐富的病理醫師對病理組織免疫標記結果分析和計數。染色結果為棕黃色或棕褐色，則判定為陽性；細胞無色或淡黃色，則判定為陰性。

1.3.2 細胞ROS水平檢測：收集各組膀胱癌T24細胞，按照ROS檢測試劑盒說明書測定各組細胞ROS相對含量。

1.3.3 Transwell實驗檢測膀胱癌T24細胞遷移、侵襲情況： 收集各組膀胱癌T24細胞，無胎牛血清培養液稀釋成1×104個/ml，取500 μl置于Transwell小室上層，下室加500 μl完全培養液，37℃、5% CO2培養箱中培養48 h，去除培養液，甲醇固定后結晶紫染色，拍照后計數每個視野的細胞數量以檢測細胞遷移情況，每個小室5個不同視野計數并取平均值為遷移細胞數量。Transwell小室經基質膠包被，其余步驟與遷移步驟相同以檢測細胞侵襲情況。

1.3.4 蛋白免疫印跡(WB)檢測細胞中SRC、p-SRC、FAK、p-FAK、MMP-9、calpain2蛋白表達： 收集各組膀胱癌T24細胞，蛋白裂解液裂解細胞，4℃離心收集上清，BCA試劑盒測定蛋白總濃度。每孔上樣30 ng，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，聚偏氟乙烯膜轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應加入一抗SRC、p-SRC、FAK、p-FAK、MMP-9、calpain2、GAPDH(均為1∶2 000)，4℃孵育過夜；對應加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

2 結 果

2.1 癌旁組織、膀胱癌組織中SRC、FAK陽性表達比較 SRC陽性表達于細胞膜上，FAK陽性表達于細胞漿中，見圖1。與癌旁組織比較，膀胱癌組織中SRC、FAK陽性比例升高(P<0.01)，見表1。69例膀胱癌患者癌組織中，SRC陽性表達39例(56.52%)，FAK陽性表達44例(63.77%)。

表1 膀胱癌患者癌組織及癌旁組織SRC、FAK陽性表達比較 [例(%)]

2.2 膀胱癌組織SRC、FAK表達陽性率在不同臨床病理特征中比較 膀胱癌組織中SRC、FAK表達陽性率在不同分化程度中比較差異無統計學意義(P>0.05)，而在浸潤性膀胱癌組織中陽性率高于非浸潤性癌組織(P<0.05)，見表2。

表2 膀胱癌組織SRC、FAK表達陽性率在不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 3組膀胱癌T24細胞ROS相對含量比較 與對照組(0.45±0.08)比較，DMTU干預組(0.26±0.04)含量下降；與DMTU干預組比較，DMTU+PP2干預組(0.64±0.03)升高，差異均有統計學意義(F=73.011，P=0.000)。

2.4 3組膀胱癌T24細胞遷移、侵襲比較 與對照組比較，DMTU干預組細胞遷移、侵襲數量升高(P<0.05)；與DMTU干預組比較，DMTU+PP2干預組細胞遷移、侵襲數量降低(P<0.05)，見圖2、表3。

注：SRC.類固醇受體共激活因子；FAK.黏著斑激酶

注：DMTU.N,N'-二甲基硫脲；PP2.SRC激酶抑制劑

表3 3組膀胱癌T24細胞遷移、侵襲數量比較個/HP)

2.5 3組膀胱癌T24細胞中SRC、p-SRC、FAK、p-FAK、MMP-9、calpain2蛋白表達比較 與對照組比較，DMTU干預組細胞中p-SRC/SRC、p-FAK/FAK、MMP-9、calpain2蛋白水平升高(P<0.05)；與DMTU干預組比較，DMTU+PP2干預組細胞中SRC、p-SRC/SRC、p-FAK/FAK、MMP-9、calpain2蛋白水平降低(P<0.05)，見圖3、表4。

表4 3組膀胱癌T24細胞中SRC、p-SRC、FAK、p-FAK、MMP-9、calpain2蛋白水平比較

3 討 論

據統計，中國膀胱癌發病率為8.05/10萬，病死率達3.29/10萬，難根治、易復發、易耐藥、易轉移等，導致膀胱癌5年生存率在50%左右[7]。盡管膀胱癌采取多種方法進行治療，但患者由于自身并發癥等原因導致不耐受，影響治療[8]。發現與膀胱癌有關基因對于及早對應治療具有至關重要作用。

注：DMTU.N,N'-二甲基硫脲；PP2.SRC激酶抑制劑；SRC.類固醇受體共激活因子；p-SRC.磷酸化SRC；FAK.黏著斑激酶；p-FAK.磷酸化FAK；MMP-9.基質金屬蛋白酶9；calpain2.鈣蛋白酶2；GAPDH.內參基因

本研究發現，膀胱癌細胞中ROS降低，ROS及其所導致的氧化應激一直以來是腫瘤發生、發展及耐藥的主要原因，適度ROS可促進腫瘤增殖，過度ROS可促進腫瘤細胞凋亡和壞死[9]。ROS穩定對于維持機體正常生理活動具有重要作用，正常情況下，機體氧化—抗氧化系統處于動態平衡，ROS作為信號因子參與細胞增殖、生長、分化等細胞存活途徑[10]。在膀胱癌中ROS生成破壞細胞內氧化還原體系平衡，可引起DNA損傷、促進關鍵蛋白氧化[11-12]。ROS調控黏附分子的表達和血管形成等過程，影響腫瘤的侵襲和轉移[13-14]。降低膀胱癌細胞中ROS水平可能促進黏附分子的表達從而促進細胞遷移、侵襲，進而加重疾病。

本研究發現，在膀胱癌中,SRC、FAK蛋白陽性率升高，且SRC、FAK蛋白陽性表達與癌組織浸潤性關系密切。SRC在腫瘤細胞中異常活化，可迅速激活下游信號通路因子磷酸化，通過復雜信號傳導影響細胞黏附，進而影響腫瘤的生長和轉移[15]。SRC可通過肌動蛋白應力纖維的拆卸、絲足體的組裝和黏著斑的共同作用調控細胞的運動[16]；其是腫瘤獲得遷移潛能的核心分子，可促進多種蛋白表達進而促進腫瘤的遷移、侵襲[17]。FAK是內源性蛋白酪氨酸激酶激活的主要底物，與腫瘤細胞黏附、增殖、遷移、侵襲等過程密切相關[18]。SRC通過其SH2結構域與FAK的Tyr397自動磷酸化位點直接結合形成FAK-SRC復合物，進而向胞內傳遞信號，促使細胞增殖、遷移、侵襲[19]。SRC、FAK蛋白水平升高可能促進腫瘤細胞侵襲、遷移過程，促進癌細胞浸潤，促使疾病發生。清除ROS后細胞SRC、FAK磷酸化水平升高，促進侵襲、遷移相關蛋白MMP-9、calpain2蛋白表達，而FAK可以直接刺激MMP-9的分泌，參與膀胱間質成分的代謝，參與血管新生、影響細胞黏附作用從而影響腫瘤遷移、侵襲[20]。calpain2與FAK蛋白進行剪切進而影響FAK活性，從而改變細胞局部的黏附能力，可能是調控細胞遷移的機制之一[21-22]。提示降低ROS水平可促進SRC的表達及其磷酸化水平，從而與FAK結合進入細胞內促進MMP-9等基因的表達，進而促進細胞的侵襲、遷移，腫瘤浸潤從而影響疾病。抑制SRC表達可抑制上述過程。

綜上所述，在膀胱癌細胞中抑制ROS可促進SRC/FAK信號通路進而促進細胞遷移、侵襲過程，使腫瘤浸潤誘導疾病。SRC/FAK信號通路亦影響細胞凋亡等過程進而影響腫瘤進展，是以后研究的重點。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

羅華榮：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；王天如、陳晨：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；黃盛松、卞崔冬：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；孫祖俊：進行統計學分析；吳登龍：課題設計，論文撰寫