非小細胞肺癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平及臨床意義

黃祥，魏丹丹，王云，鮑捷

在世界范圍內肺癌發病率、病死率均較高，是癌癥死亡的主要原因之一，包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌2個主要類型，其中非小細胞肺癌約占肺癌總數的85%[1]。肺癌患者預后狀況主要依賴于臨床的早期診斷和早期治療，其中手術切除是治療肺癌的有效手段，然而其5年術后生存率仍不高[2]。尋找與肺癌發生發展及預后相關的生物標志物，對改善預后有重要意義。微小RNA-454-3p(microRNA-454-3p，miR-454-3p)在多種類型的癌癥中均異常表達，可發揮致癌或抑癌基因的作用，且研究表明，miR-454-3p在肺癌中高表達[3-5]。胞質多聚腺苷酸化成分結合蛋白1(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1，CPEB1)在結直腸癌、胃癌等腫瘤細胞中表達水平均下降[6-7]。通過生物信息學預測網站miRDB(http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi)預測發現，miR-454-3p與CPEB1存在靶向結合位點。推測miR-454-3p可能靶向調控CPEB1進而參與肺癌的發生發展。本研究通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測非小細胞肺癌組織中miR-454-3p、CPEB1 信使RNA(mRNA)表達，探討二者與臨床病理特征及預后的關系，以期為非小細胞肺癌患者治療提供新靶點，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年4月—2016年3月在中國科學院合肥腫瘤醫院經胸部影像學及組織病理學等確診為非小細胞肺癌患者96例，術中取其癌組織設為肺癌組，癌旁正常組織為對照組。其中男59例，女37例，年齡44～76(56.48±10.24)歲，≤55歲43例，>55歲53例；有吸煙史40例，無吸煙史56例；腫瘤直徑≤3 cm 50例，>3 cm 46例；病理類型：腺癌41例，鱗癌55例；有淋巴結遠處轉移者42例，無淋巴結遠處轉移者54例；分化程度：中/高分化55例，低分化41例；TNM分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期39例。本研究經中國科學院合肥腫瘤醫院倫理委員會批準(批號LS-20140317)。患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①患者均符合“中國原發性肺癌診療規范(2015年版)”中關于非小細胞肺癌的診斷標準[9]；②均為初治患者，患者術前未接受過化療、放療等輔助治療；③病歷資料及影像學檢查信息完整者。(2)排除標準：①有嚴重肝腎功能異常及其他急慢性感染性疾病者；②有其他肺部疾病者；③妊娠期及哺乳期婦女；④伴有其他部位惡性腫瘤或有惡性腫瘤史者。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平測定： 采用RNA提取試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司)及反轉錄試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)提取肺癌組織總RNA并反轉錄為cDNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用qRT-PCR儀(型號7300，美國ABI公司)對miR-454-3p、CPEB1 mRNA及其內參(miR-454-3p以U6作為內參，CPEB1 mRNA以GAPDH作為內參)進行擴增，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。qRT-PCR反應體系：cDNA(50 ng/μl)1 μl，qPCR SYBR?Green Master Mix(熒光定量PCR試劑，武漢純度生物科技有限公司) 5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，ddH2O 3.2 μl。每份樣品設3個重復孔，采用2-△△CT法計算組織miR-454-3p、CPEB1 mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 隨訪： 采用電話或門診等方式對患者隨訪5年，術后第1年每月1次，術后第2年每3個月1次，2年后每6個月1次。患者生存期從手術之日起計算，隨訪時間截止到2021年3月31日，統計5年內患者的生存情況。

2 結 果

2.1 2組miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平比較 肺癌組miR-454-3p表達水平高于對照組，CPEB1 mRNA表達水平低于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 2組miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平比較

2.2 癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平在不同臨床病理特征中比較 以患者癌組織中miR-454-3p(均值1.56)、CPEB1 mRNA(均值0.67)表達水平為界，將患者分為miR-454-3p低表達亞組47例，miR-454-3p高表達亞組49例，CPEB1 mRNA低表達亞組50例，CPEB1 mRNA高表達亞組46例。結果顯示，患者癌組織miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平在不同性別、年齡、吸煙史、分化程度中比較差異無統計學意義(P>0.05)，而在不同腫瘤直徑、病理類型、淋巴結遠處轉移、TNM分期中比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 肺癌患者癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平在不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 癌組織中miR-454-3p與CPEB1 mRNA表達水平的相關性 非小細胞肺癌患者癌組織中miR-454-3p與CPEB1 mRNA表達呈負相關(r=-0.524，P=0.000)。

2.4 患者癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平與預后的關系 采用Kaplan-Meier法分析癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平與患者生存率的關系，結果顯示96例患者5年存活46例，死亡50例。miR-454-3p高表達患者5年生存率34.69%(17/49)低于miR-454-3p低表達患者61.70%(29/47)，差異有統計學意義(χ2=7.012，P=0.008)；CPEB1 mRNA高表達患者5年生存率58.70%(27/46)高于CPEB1 mRNA低表達患者38.00%(19/50)，差異有統計學意義(χ2=4.112，P=0.043)。

2.5 影響非小細胞肺癌患者預后的多因素Logistic回歸分析 以肺癌患者是否死亡為因變量，以miR-454-3p、CPEB1 mRNA、腫瘤直徑、病理類型、淋巴結遠處轉移、TNM分期為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，miR-454-3p高表達、淋巴結遠處轉移是影響非小細胞肺癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)，CPEB1 mRNA高表達是影響患者死亡的保護因素(P<0.01)，見表4。

表4 影響非小細胞肺癌患者預后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

肺癌是一種源于支氣管黏膜的高度惡性腫瘤，其具體的分子機制尚不明確，盡管近年來其治療方法更加個體化和多樣化，但其預后和療效仍不十分理想，嚴重威脅患者的生命健康[10-12]。近年來，分子靶向治療在肺癌患者中已取得了較大進步，可有效改善預后，且療效有持續作用，為晚期肺癌患者帶來新希望[13-14]。但仍有部分患者未從中獲益，因此，需探索更多新的分子靶向生物標志物來滿足臨床需求。

許多miRNA可通過調控靶基因表達，參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[15-18]。miR-454-3p是近年來發現的參與多種腫瘤生物過程的miRNA[19-20]。CPEB1是一類特殊序列的mRNA結合蛋白，它在配子形成、細胞衰老、癌癥病因等方面發揮重要作用，控制健康與疾病的轉化。CPEB1可通過調控mRNA poly(A)的長度影響翻譯過程[21-22]。Hui等[23]研究結果顯示，miR-454-3p通過過表達下調CPEB1進而抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結果中，miR-454-3p在非小細胞肺癌組織中的表達水平高于對應的癌旁正常組織，CPEB1 mRNA表達水平低于癌旁正常組織，且在肺癌組織中二者表達水平呈負相關，miR-454-3p表達趨勢與Jin等[5]在肝細胞癌中研究結果相符，但miR-454-3p、CPEB1表達與Hui等[23]報道二者在膠質母細胞瘤中的表達趨勢不相符，分析其表達差異可能是由于miR-454-3p、CPEB1在膠質母細胞瘤和肺癌中調控的通路及發揮的作用不一致，提示miR-454-3p可能通過高表達下調CPEB1進而促進肺癌的發生發展。本研究中患者癌組織miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平與腫瘤直徑、病理類型、淋巴結遠處轉移、TNM分期有關。提示miR-454-3p、CPEB1可能與肺癌細胞的增殖、遷移及侵襲等行為密切相關，推測高表達的miR-454-3p靶向下調CPEB1表達水平，CPEB1調控特殊時期mRNA poly(A)的長度，進而調控mRNA多聚腺苷化的作用減弱，最終影響翻譯過程和細胞周期，增加惡性轉化的發生；亦或CPEB1表達下調后使細胞黏附力降低，可能導致上皮間質轉化，增加癌細胞遷移和侵襲能力。此外，本研究發現miR-454-3p高表達、CPEB1 mRNA低表達的患者5年生存率較低，miR-454-3p高表達是影響非小細胞肺癌患者死亡的獨立危險因素，CPEB1 mRNA高表達是影響患者死亡的保護因素。提示臨床醫師可通過密切監測miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平是否異常，及時調整治療方案，阻止不良預后發生。

綜上所述，非小細胞肺癌組織中miR-454-3p呈高表達，CPEB1 mRNA呈低表達，與非小細胞肺癌發生發展及預后有密切聯系，對非小細胞肺癌調控機制的進一步研究有重要作用。此外，本研究可能為提高非小細胞肺癌患者診療效果提供新思路，對今后尋找新的治療靶點起到積極的推動作用。然而本研究存在不足之處，miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達可能與腫瘤位置、患者個體狀態等各方面因素有關，有待今后納入更多樣本和影響因素進行多中心的前瞻性研究來進一步驗證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

黃祥：設計研究方案，課題設計，實施研究過程，論文撰寫；魏丹丹：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；王云：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；鮑捷：進行統計學分析