紫云英苷對慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化及AMPK/Nrf2通路的影響

邵會敏，曹新營，劉志亮，徐英利，魏國清

慢性心力衰竭是由結構異常、功能障礙、代謝紊亂和/或藥物刺激引起的復雜疾病，是各種心血管疾病的最終臨床表現，心力衰竭發展的基本機制是心室重構[1]。心室重構是指由心肌損傷及壓力和容量超負荷變化引起的心室質量、大小和形狀的變化。心室重構主要包括心肌細胞和間質的重建。心肌間質重構是指心肌細胞外基質的變化，包括成纖維細胞增生和纖維化，血管結構變化及細胞外基質和膠原網絡的體積和組成變化[2-3]。內質網(ER)是一種動態而穩定的細胞器，參與蛋白質和脂質的合成及Ca2+濃度的調節。細胞暴露于缺氧或某些化學治療藥物會導致未折疊蛋白質的積累和鈣穩態的改變，從而導致內質網應激(ERS)。ERS激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，這是一種代謝敏感的蛋白激酶，可調節細胞穩態和新陳代謝[4]。ERS還以依賴性方式誘導核因子E2相關因子2(Nrf2)核易位，激活AMPK和Nrf2可以減少心肌纖維化損傷并改善心臟功能[5-6]。紫云英苷是一種黃酮類化合物，對多種人類疾病均顯示出治療功效[7]。研究證明，紫云英苷對脂多糖誘發的大鼠小腸上皮細胞炎性反應模型具有明顯抗炎作用[8]。此外，紫云英苷可抑制卵巢癌細胞增殖和侵襲[9]。但是，對于慢性心力衰竭、心肌纖維化，紫云英苷是否具有治療作用尚未有研究。本研究擬探討紫云英苷對慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的作用及AMPK/Nrf2通路的影響，為慢性心力衰竭的治療提供理論依據，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)動物：SPF級SD大鼠60只，雌雄不限，8周齡，體質量220～280 g，購自四川大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(川)2019-0001，動物使用許可證號：SYXK(川)2019-0012，動物質量合格證號：SD531107，大鼠置于(25±1)℃、60%濕度的受控環境中，12 h明/暗循環，可自由飲水。本研究經醫院倫理委員會批準(審批號：倫理LD2020-067)。(2)試藥試劑：紫云英苷(原料藥，純度≥98%，江蘇永健醫藥科技有限公司)；卡托普利片(中美上海施貴寶制藥有限公司)；馬森(Masson)染色試劑盒、蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒(上海科匯生物技術有限公司)；TRIzol試劑、cDNA逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)、RIPA裂解緩沖液(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BCA蛋白質測定試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國EMD Millipore公司)；兔抗鼠AMPK抗體、兔抗鼠Nrf2抗體、兔抗鼠GAPDH抗體、兔抗鼠二抗(美國Cell Signaling Technology公司)；增強的化學發光(ECL)試劑盒(英國Amersham公司)；(3)儀器：彩色多普勒超聲診斷儀(深圳開立生物醫療科技股份有限公司，型號M22)；顯微鏡(蘇州瑞文光電科技有限公司，型號RWOPTICS MX50M)；實時熒光定量PCR系統(美國Applied Biosystems公司，型號7900HT)；凝膠成像分析系統(北京中西遠大科技有限公司，型號CDD1-BOT-860)。

1.2 造模方法與分組 2020年8—9月于華北理工大學附屬醫院基礎實驗室進行實驗，參照文獻[10]的方法進行慢性心力衰竭造模：大鼠腹膜內注射水合氯醛(10%)麻醉，仰臥固定于手術床，切開心包暴露心臟，4-0縫線針穿過左心耳下方2～3 mm， 結扎時放置1.5 mm直徑乳膠管，擰緊結扎阻塞流向冠狀動脈的血流，從而引起心肌缺血；0.5 h后釋放結扎線，進行2 h血液灌流，形成慢性心力衰竭模型；另選取12只大鼠作為空白對照組(不進行任何處理)。造模大鼠心功能指標左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室收縮末期內徑(LVESD)水平較空白對照組明顯升高，左心室短軸縮短率(FS)、左心室射血分數(LVEF)水平較空白對照組明顯降低，說明建模成功；將造模成功的48只大鼠隨機數字表法分為模型組、卡托普利組(10 mg/kg與生理鹽水制成濃度為1 mg/ml 溶液，灌胃體積10 ml/kg)[11]、紫云英苷低劑量組(25 mg/kg與生理鹽水制成濃度為2.5 mg/ml溶液，灌胃體積10 ml/kg)、紫云英苷高劑量組(50 mg/kg與生理鹽水制成濃度為5 mg/ml的溶液，灌胃體積10 ml/kg)[12]，每組12只； 空白對照組和模型組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續給藥4周。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 大鼠心功能指標測定：連續給藥4周后，采用彩色多普勒超聲診斷儀檢查和計算大鼠LVEF、FS、LVESD和LVEDD水平。

1.3.2 大鼠心肌纖維化程度測定： 頸椎脫臼處死大鼠，取大鼠左心室組織，4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇脫水，石蠟包埋，切成5 μm薄片、Masson染色，置于顯微鏡下觀察，然后采用電腦圖像分析系統自動測量心肌間質膠原面積、視野心肌組織總面積、血管周圍膠原面積、血管管腔面積，計算心肌膠原容積分數(CVF)和血管周圍膠原面積與血管管腔面積比值(PVCA/LA)[13]，CVF=心肌間質膠原面積/視野心肌組織總面積×100%，PVCA/LA=血管周圍膠原面積/血管管腔面積×100%，CVF、PVCA/LA水平越高，說明組織纖維化程度越重。

1.3.3 大鼠心肌組織形態學觀察： 取大鼠心肌組織，于4%多聚甲醛中固定48 h，將組織進行乙醇脫水，石蠟包埋，然后切成薄片(5 μm)，HE染色以進行組織學分析。

1.3.4 心肌組織AMPK、Nrf2 mRNA水平測定： 裂解心肌細胞，使用TRIzol試劑提取心肌組織總RNA，使用cDNA逆轉錄試劑盒對RNA(1 μg)進行逆轉錄，使用實時熒光定量PCR系統和SYBR Premix Ex Taq進行PCR反應。AMPK、Nrf2、GAPDH引物由美國Thermo Fisher Scientific公司合成，序列如下：AMPK上游5’-TGACAATGCCGTCTGAACTG-3’，AMPK下游5’-CATCACCATCGCAAGGAACT-3’；Nrf2上游5’-GTGACTTGCCGTCTGGGTGAC-3’，Nrf2下游5’-TGTGTGACCATCGCAAGGGTG-3’；GAPDH上游5’-ATTCGCAGGTACTTGCCT-3’，GAPDH下游5’-CGGATGGCCTAACTCCTG-3’。 熱循環條件：在94℃初始變性2 min；隨后進行45個循環：95 ℃ 30 s，57.5 ℃ 30 s和72 ℃ 60 s；最后在72℃延伸10 min。使用2-ΔΔCt方法計算相對mRNA表達水平。

1.3.5 心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平測定： 使用RIPA裂解緩沖液裂解處理過的心肌組織，使用BCA蛋白質測定試劑盒測量蛋白質濃度，電泳分離蛋白質10 μg，將蛋白質轉移到PVDF膜上，在37 ℃下用5%牛血清白蛋白封閉2 h后，將膜與一抗[兔抗鼠AMPK抗體(1∶500)、兔抗鼠Nrf2抗體(1∶1 000)、兔抗鼠GAPDH抗體(1∶1 000)]一起孵育過夜，加入二抗(1∶3 000)并孵育2 h，使用增強ECL溶液檢測抗原—抗體條帶，使用Bio-Rad軟件通過光密度分析進行條帶的定量，GAPDH作為內部對照。

2 結 果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 與空白對照組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD水平升高，FS、LVEF水平降低(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組及紫云英苷高、低劑量組大鼠LVEDD、LVESD水平降低，FS、LVEF水平升高(P<0.05)；紫云英苷高劑量組大鼠LVEDD、LVESD水平低于紫云英苷低劑量組，FS、LVEF水平高于紫云英苷低劑量組(P<0.05)；卡托普利組和紫云英苷高劑量組大鼠LVEDD、LVESD、FS、LVEF水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠心功能指標比較

2.2 各組大鼠心肌纖維化程度比較 與空白對照組比較，模型組大鼠CVF、PVCA/LA水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組、紫云英苷各劑量組大鼠CVF、PVCA/LA水平降低(P<0.05)；紫云英苷高劑量組大鼠CVF、PVCA/LA水平低于紫云英苷低劑量組(P<0.05)；卡托普利組和紫云英苷高劑量組大鼠CVF、PVCA/LA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠心肌纖維化程度比較

2.3 各組大鼠心肌病理結構比較 空白對照組心肌結構正常；模型組心肌橫紋紊亂，心肌組織纖維化明顯，有明顯炎性細胞浸潤；卡托普利組及紫云英苷高、低劑量組心肌組織纖維化程度減輕，炎性細胞浸潤減少，心肌纖維排列整齊，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌病理結構比較(HE染色，×200)

2.4 各組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組、紫云英苷各劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平升高(P<0.05)；紫云英苷高劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平高于紫云英苷低劑量組(P<0.05)；卡托普利組和紫云英苷高劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平比較

2.5 各組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組、紫云英苷各劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平升高(P<0.05)；紫云英苷高劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平高于紫云英苷低劑量組(P<0.05)；卡托普利組和紫云英苷高劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表4、圖2。

表4 各組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平比較

注:A.空白對照組;B.模型組;C.卡托普利組;D.紫云英苷低劑量組;E.紫云英苷高劑量組

3 討 論

紫云英苷已被證明可通過改善內皮功能，抑制炎性細胞因子，增強一氧化氮合成，恢復受損的自主神經功能，逆轉慢性心力衰竭病理性心肌重構，并抑制心肌細胞凋亡[14]。心肌纖維化是心臟代償失調和心力衰竭的主要原因[15]。有研究表明，紫云英苷能夠改善心力衰竭大鼠心功能和心臟膠原蛋白水平[16]。本結果顯示，模型組大鼠LVEDD、LVESD、CVF、PVCA/LA水平高于空白對照組，FS、LVEF水平低于空白對照組；紫云英苷低、高劑量組大鼠LVEDD、LVESD、CVF、PVCA/LA水平低于模型組，FS、LVEF水平高于模型組；且紫云英苷高劑量組大鼠上述指標優于紫云英苷低劑量組。表明紫云英苷對慢性心力衰竭大鼠心功能指標和心肌纖維化程度均有明顯改善作用。本結果顯示，模型組心肌橫紋紊亂，心肌組織纖維化明顯，有明顯炎性細胞浸潤；卡托普利、紫云英苷干預后，心肌組織纖維化程度減輕，炎性細胞浸潤減少，心肌纖維排列整齊。表明紫云英苷對慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化具有明顯抑制作用。

Nrf2在緩解各種由炎性反應和氧化應激引起的疾病(如慢性阻塞性肺疾病、哮喘)中起關鍵作用[17-18]。在正常生理條件下，Nrf2結合到細胞質中Kelch樣環氧氯丙胺相關蛋白1(Keap1)上，并通過遍在蛋白—蛋白酶體途徑降解[19]。然而，暴露于應激源和誘導劑后，Keap1中釋放的Nrf2易位到細胞核中，導致各種細胞的保護性基因表達，與保守的抗氧化劑反應元件結合。在此過程中，AMPK介導了糖原合成酶激酶3β的失活，從而增加了Nrf2的細胞核積累[20]。AMPK是細胞代謝的關鍵能量傳感器，它參與代謝應激，包括神經變性、炎性反應和氧化應激[21]。此外，研究表明[22]，AMPK作為炎性反應負調節劑，在脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠模型中起保護作用。近期研究表明，心肌纖維化可能通過誘導過多的心肌ERS引起心肌損害，檢測ER相關蛋白的表達水平可能反映心肌纖維化對心肌損害的程度[23]。本結果發現，模型組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平低于空白對照組；紫云英苷低、高劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平高于模型組；且紫云英苷高劑量組高于紫云英苷低劑量組，表明紫云英苷可能通過促進心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白表達激活AMPK/Nrf2通路進而減輕心肌纖維化程度。有研究發現，激活AMPK信號通路可顯著改善心臟功能，減少細胞凋亡，抑制ERS并減輕心肌缺血/再灌注誘導的心肌損害[24]。生長激素釋放肽(ghrelin)是一種心臟保護肽，它通過激活AMPK信號通路并抑制ERS誘導的損傷和凋亡來保護心臟免受缺血/再灌注損傷[25]；金絲桃苷通過激活Nrf2信號通路增加心肌三磷酸腺苷水平，減少心肌的氧化損傷及心肌細胞的凋亡[26]，與本結果一致。

綜上所述，紫云英苷可改善慢性心力衰竭大鼠心功能，減輕心肌纖維化程度，其機制可能與紫云英苷激活AMPK/Nrf2通路有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

邵會敏：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；曹新營：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；劉志亮：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；徐英利：進行統計學分析；魏國清：課題設計，論文撰寫