小檗堿對大鼠壓力超負荷肥厚心肌組織miR-21-3p表達的影響及其干預心肌肥厚的作用機制

劉盛祥，黃宇鵬，楊國康，金紅艷

心肌肥厚是心肌細胞為克服增高的壓力負荷，保證心臟充足射血量的一種代償性反應，長期、嚴重的心肌肥厚引起心肌結構及功能的失代償，最終導致心律失常、心力衰竭及猝死等不良心血管事件的發生[1]。小檗堿是一種從植物中提取的異喹啉類生物堿，具有一定的抗心肌肥厚作用，但其在心肌肥厚中的具體分子機制尚不明確[2]。微小RNA(micro RNA，miRNA)是內源性小分子非編碼RNA，大量研究證實，miRNA在心肌肥厚中發揮著關鍵作用[3-4]。本研究為證實小檗堿在抗心肌肥厚中的作用是否與miRNA相關，構建壓力負荷誘導下的大鼠心肌肥厚模型，探討小檗堿對心肌肥厚的影響及其可能機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：SPF級健康雄性SD大鼠36只,8～10周齡,體質量160～200 g,由武漢科技大學實驗動物中心提供,動物許可證為SYXK(新)2016-003、合格證為SCXK(新)2016-0002。(2)藥物及試劑：鹽酸小檗堿(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，一抗AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β及內參GAPDH(北京科海瑞嘉生物科技有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)。(3)儀器設備：飛利浦HD11 XE超聲診斷儀(德國Philips公司)、移液槍(德國Eppendorf公司)、實時熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)、凝膠成像儀(美國Protein Simple公司)。

1.2 實驗方法 2019年6月—2020年9月于武漢科技大學實驗動物中心進行實驗。心肌肥厚模型的構建：SPF級雄性SD大鼠36只，采用隨機數字表法分為假手術組、模型組及小檗堿組，每組12只。模型制備方法參照文獻[5]，大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥麻醉，分離肌肉及組織，游離腹主動脈，模型組大鼠掛線結扎腹主動脈，超聲多普勒檢測腹主動脈達到70%狹窄視為造模成功；假手術組只暴露腹主動脈后關腹不做任何處理；小檗堿組大鼠在模型組基礎上予以小檗堿100 mg·kg-1·d-1灌胃處理，假手術組及模型組給予等劑量的生理鹽水灌胃處理。術后40 d用2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后行心臟超聲檢測，完畢后立即取出心臟備用。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 心臟超聲指標檢測：麻醉大鼠后使用高頻超聲診斷儀檢測各組大鼠的心臟指標，包括左心室舒張末期后壁厚度(LVPWT)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室射血分數(LVEF)。

1.3.2 心體質量比檢測：取出大鼠心臟后，清除心腔血液，預冷的生理鹽水清洗心腔，用濾紙吸干水分后，計算心體質量比(心臟質量/體質量)。

1.3.3 心肌組織miR-21-3p、ANP、BNP基因表達：采用RT-qPCR方法檢測。以Trizol法從大鼠心肌組織中提取總RNA，通過反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，取2 μl產物在熒光定量PCR儀器中擴增。總反應體系為20 μl，擴增步驟如下：95℃預變性30 s、95 ℃變性5 s，60℃擴增30 s，反復40個循環后進行解離：95℃持續5 s、60℃持續60 s。心房鈉尿肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)表達檢測以GAPDH為內參，miR-21-3p表達檢測以U6為內參，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.4 心肌組織AKT、p-AKT、GSK3β和p-GSK3β蛋白表達檢測：用含有1%蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解心肌組織，研磨勻漿后4 ℃下離心獲得全蛋白質，每個樣品取等量的蛋白質(20 μg)用10%凝膠進行免疫印跡，然后將其轉移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉，加入相應比例稀釋的一抗(目的基因AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β及內參GAPDH稀釋比例均為1∶1 000)，在4℃搖床孵育過夜；次日用TBST將膜洗滌3次，并用對應的二抗孵育1 h，用TBST洗滌3次后配制ECL發光反應液，置于凝膠成像系統中觀察蛋白的表達情況 。

2 結 果

2.1 3組大鼠心臟超聲指標比較 與假手術組比較，模型組 LVPWT增加(t/P=4.811/0.001)， LVEDD、LVEF減小(t/P=5.303/0.001、5.855/0.000)。與模型組比較，小檗堿組大鼠LVPWT減小(t/P=2.864/0.021)，LVEDD、LVEF增加(t/P=4.518/0.002、2.841/0.022)，見表2。

表2 3組大鼠心臟超聲指標比較

2.2 3組大鼠心體質量比比較 與假手術組比較，模型組大鼠心臟質量、心體質量比均增加(t/P=6.704/0.000、9.664/0.000)。與模型組比較，小檗堿組大鼠心臟質量、心體質量比減小(t/P=3.929/0.004、3.866/0.005)。3組大鼠體質量比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 3組大鼠心臟質量、體質量比較

2.3 3組大鼠心肌組織中ANP、BNP及miR-21-3p表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織ANP、BNP、miR-21-3p表達水平明顯上調(t/P=17.043/0.000、22.445/0.000、24.254/0.000)；與模型組比較，小檗堿組大鼠心肌組織ANP、BNP、miR-21-3p表達水平顯著下調(t/P=8.845/0.000、9.514/0.000、15.376/0.000)，見圖1。

注：ANP.心房鈉尿肽；BNP.腦鈉肽；miRNA-21-3p.微小RNA-21-3p。與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.4 3組大鼠心肌組織中AKT、GSK3β蛋白及磷酸化水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織p-AKT、p-GSK3β蛋白水平顯著上調(t/P=22.767/0.000、28.647/0.000)；與模型組比較，小檗堿組大鼠心肌組織p-AKT及p-GSK3β蛋白水平顯著下調(t/P=20.090/0.000、27.945/0.000)，而3組大鼠AKT、GSK3β的蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

注：A.蛋白表達免疫印跡圖；B.蛋白定量表達比較。與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3 討 論

心肌肥厚是指心肌組織應對心臟負荷的一種代償性反應，早期肥大的心肌細胞可以減輕心室壁的壓力維持足夠的心排出量，但長期持續的高負荷狀態最終引起心臟失代償，導致心室的收縮及舒張功能障礙，最終發展成心力衰竭[6]。心肌肥厚包括心肌細胞的體積增大及心肌間質細胞的增生，多個基因及信號通路參與心肌肥厚的過程[7]，但其具體機制尚未闡明。雖然有研究證實，神經體液機制參與了心肌肥厚的過程，但是對晚期心力衰竭患者的癥狀控制及遠期預后的治療依舊欠佳。因此，探究心肌肥厚的發病過程及其具體的作用機制，尋找針對心肌肥厚的潛在作用靶點，減輕心臟失代償等并發癥的發生，延緩心力衰竭的進展具有重要的臨床意義。

miRNA是一種內源性非編碼小RNA，大量的證據表明，miRNA在心肌肥厚過程中發揮著重要作用，成為治療心肌肥厚的潛在生物靶點[3, 8-9]。miR-1通過抑制Hand2的表達，以及抑制胰島素樣生長因子(IGF1)和細胞外基質重構因子Twf1的活性來防止心肌肥厚[10]。miR-223通過靶向心肌肌鈣蛋白I作用激酶(TNNI3K)，拮抗ECE-1或主動脈縮窄(TAC)誘導的心肌肥厚[11]。研究發現，在TAC或其他方式誘導的心肌肥厚模型中miR-21表達明顯上調[12]，作為miR-21的互補序列miR-21-3p是否在心肌肥厚模型發揮作用尚未明確。筆者構建了心肌肥厚模型，發現miR-21-3p在壓力負荷誘導的心肌肥厚模型中同樣表達上調。同樣在Yan[13]的研究中發現，miR-21-3p在TAC術后4周的心力衰竭模型中表達增高，而在TAC術后2周的心肌肥厚模型中表達下調，提示miR-21-3p在心肌肥厚不同階段發揮不同的作用。本研究中在腹主動脈縮窄術40 d后發現miR-21-3p的表達水平上調，且反映心力衰竭的特殊標志物ANP及BNP表達水平同樣上調，提示本研究運用腹主動脈縮窄法構建的心肌肥厚模型為心力衰竭模型，這一表型與Yan等[13]在TAC術后4周的表型基本一致。

小檗堿是一種從植物中提取的異喹啉類生物堿，具有一定的抗心肌肥厚作用[2]，其可能通過調節Rho/ROCK信號途徑及其底物磷酸化水平達到改善心肌肥厚的目的，而在本研究中發現，小檗堿通過抑制miR-21-3p水平從而抑制AKT/GSK3β信號通路達到抗心肌肥厚的作用。本研究發現在構建心肌肥厚模型40 d后，經小檗堿處理后大鼠心臟質量、心體質量比、左心室舒張末期后壁厚度減小，左心室舒張末期內徑、左心室射血分數增加，提示在壓力負荷誘導的心肌肥厚模型中小檗堿能夠抑制心肌肥厚、改善心功能。更重要是的，經小檗堿處理后miR-21-3p的表達水平明顯下調，提示小檗堿抑制心肌肥厚的作用可能與miR-21-3p的表達相關，且與這種表達呈負相關關系。AKT信號通路是心肌肥厚發生及發展過程中的關鍵因子，其下游靶點GSK3β同樣參與了這一過程[14-15]。研究發現miR-21-3p依賴HDAC8調控AKT/GSK3β信號通路參與心肌肥厚過程[13]。本研究發現，心肌肥厚模型經小檗堿處理后miR-21-3p表達水平明顯下調，而且AKT及GSK3β磷酸化水平較模型組明顯下調，進一步證實了小檗堿可能通過抑制AKT/GSK3β信號通路抑制心肌肥厚。然而本研究未檢測心肌肥厚模型中HDAC8的表達水平，不能確認小檗堿是否也依賴HDAC8發揮作用，為接下來研究小檗堿的抗心肌肥厚作用機制提供了新的思路。

綜上所述，本研究在動物模型水平提示了小檗堿通過AKT/GSK3β信號通路抑制心肌肥厚，且這一作用與miR-21-3p的表達相關，為臨床治療心肌肥厚提供了新的思路。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉盛祥：課題設計及文章撰寫；黃宇鵬：數據獲取及統計分析；楊國康：收集資料及論文修改；金紅艷：課題指導