SH2B1對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大過程中糖代謝的影響和機制研究

毛帥，王順，顏輝，楊曼琪，吳鋼

心肌肥厚是心臟應對壓力超負荷等各種刺激發生的一種適應性反應，表現為心肌細胞面積增大、間質增殖、血管生成增多、心室壁變厚等。心肌肥厚分為2種類型：妊娠、運動等引起生理性心肌肥厚，在刺激消失后往往會逆轉；而心肌梗死、高血壓等常導致病理性心肌肥厚,長期持續的病理性刺激會發生不良的后果，如心律失常、心力衰竭和心源性猝死等[1]。因此，如何干預病理性心肌肥厚并延緩病情的進程成為研究的重點。

研究發現，在病理性心肌肥厚過程中，會發生所謂的“能量代謝重編程”[2]。即在正常情況下，心臟的能量來源70%～90%來自脂肪酸，然而病理性心肌肥厚后期甚至心力衰竭時，心臟主要利用糖酵解途徑供能[3]。同源性2b銜接蛋白1(Src homology 2 binding protein 1, SH2B1) 屬于SH2B家族，是含有SH2和PH結構域的接頭蛋白，編碼的蛋白質介導各種激酶的激活，并可能在細胞因子和生長因子受體信號傳導以及細胞轉化中起作用，其缺失會導致嚴重的肥胖及瘦素、胰島素抵抗[4-5]。已有研究證實SH2B1與糖尿病患者心肌梗死、冠心病發生率密切相關。然而，關于其在病理性心肌肥厚中扮演的角色以及發揮作用的主要機制目前尚不清楚。現觀察在AngⅡ誘導心肌肥大過程中，SH2B1對心肌細胞糖代謝的影響，探討相關機制，為心肌肥厚的臨床治療提供新的治療靶標，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)原代大鼠：新生1～3 d乳鼠，雌雄不限，購于湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產許可證號：42000600016516。(2)試劑試藥：抗體SH2B1(R&D Systems)，AMPK、p-AMPK、G6PD、GAPDH及HRP標記的山羊抗兔IgG均購自Cell Signaling Technology ，TRIzol均購自invitrogen，cDNA合成試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix均購自Roche，RIPA裂解液均購自碧云天，BCA蛋白定量試劑盒均購自普利萊。PVDF膜購自Millipore， DMEM均購自Gibco, Opti-MEM均購自Gibco， iMAX均購自invitrogen，AngⅡ、 AMPK抑制劑compound C均購自Sigma-Aldrich。(3)儀器設備：倒置顯微鏡，化學發光成像系統(Bio-Rad), 細胞培養箱，LightCyclerR 480(Roche)

1.2 實驗方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞分離和處理：2016年6月—2017年2月于武漢大學第一臨床學院中心實驗室進行實驗。選取1～3 d新生乳大鼠，處死后取出心臟,置于預冷PBS緩沖液中清洗2～3次,修剪心臟除去多余的血管、心房；將心臟置入0.125%胰酶中稍剪開但不剪碎,再放入15 ml離心管中,加入0.125%胰酶10 ml靜置, 4℃過夜 ；第2天,吸出上清液,加入含0.035%膠原酶Ⅱ的消化液 6 ml,置于37℃水浴輕輕振搖3～5 min,待液體變混濁后即停止消化,重復消化6～7次。 收集上清液離心10 min,棄上清,加入適量含10%胎牛血清的完全培養液重懸細胞,接種于10 cm培養皿中進行差速貼壁1 h去除成纖維細胞,將細胞懸液接種于35 mm培養皿中,細胞密度為1×106,培養24 h后,用倒置顯微鏡觀察。

首先，將分離培養好的乳鼠心肌細胞隨機分為對照組、AngⅡ組，每3只。對照組不予任何處理，AngⅡ誘導心肌細胞肥大的方法如下：將乳鼠心室肌細胞轉染后24 h，棄去舊培養基，PBS洗1次，將AngⅡ稀釋于含1%雙抗+1%ITS的DMEM培養基中，終濃度為1 μmol/ml。加入AngⅡ刺激24 h后，收集細胞用于實驗。

為了進一步探索SH2B1在心肌肥厚中發揮的作用，將乳鼠心肌細胞分為對照組、AngⅡ組、siSH2B1組、siSH2B1+ AngⅡ組,每3只。使用invitrogen公司的iMAX轉染試劑盒轉染細胞，按照使用說明書操作，以35 mm培養皿為例：鋪好乳鼠心室肌細胞24 h后，轉染前將完全培養基更換成含1%雙抗+1%ITS的DMEM培養基。配置轉染工作液，取4 μl siRNA,加入opti-MEM稀釋至總體積為100 μl,室溫放置。取iMAX 6 μl，加入opti-MEM稀釋至總體積為100 μl，室溫放置5 min。將稀釋的iMAX加入稀釋的siRNA中輕輕混勻，室溫放置15 min。將轉染工作液輕輕混勻，逐滴加入2 ml培養基中，輕輕混勻培養基，將細胞放回培養箱中繼續培養24 h。接著使用AMPK抑制劑compound C處理乳鼠心肌細胞，將乳鼠心肌細胞分為對照組、AngⅡ組、AngⅡ+compound C組，直接向含有2 ml培養基的心肌細胞中加入用5μmol 的AMPK抑制劑compound C處理細胞，45 min后再加入1 μmol AngⅡ，將細胞放回培養箱繼續培養24 h。

1.2.2 熒光定量PCR檢測ANP、BNP基因表達：使用TRIzol從新鮮乳鼠心室肌細胞中提取總RNA。利用cDNA合成試劑盒合成cDNA。然后，采用SYBR Green PCR Master Mix進行熒光定量PCR，以內源性GAPDH為對照，量化目標基因的相對表達水平。用于擴增的引物序列如下：(1)心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)：5'-ATACAGTGCGGTGTCCAACA-3' (上游)和5'-AGCCCTCAGTTTGCTTTTCA-3'(下游)； (2)腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)：5'-CAGCTCTCAAAGGACCAAGG-3'(上游)和5'-GCAGCTTGAACTATGTGCCA-3'(下游)；(3)GAPDH：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'(上游)和5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'(下游)。

1.2.3 Western Blot法檢測SH2B1、GLUT4、C6PD蛋白水平：用RIPA裂解液從新鮮乳鼠心室肌細胞中提取蛋白質，形成蛋白溶液。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE對每個樣品中等量的蛋白質(20 μg)進行分離，然后轉移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后，將這些膜與以下相對應的一抗在4℃下孵育過夜：AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、SH2B1(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)。然后，在室溫下與一抗相應的辣根過氧化物酶結合二抗孵育2 h。后使用化學發光顯影液在化學發光成像系統上曝光顯示目標條帶，并將目標條帶用image J (National Institutes of Health)進行量化分析。以GAPDH蛋白含量作為內參進行標準化，得到每個樣本中目的蛋白的相對表達水平。

2 結 果

1.1 AngⅡ誘導心肌細胞肥大過程中SH2BI表達和糖代謝改變 與對照組比較，AngⅡ組ANP、BNP mRNA表達明顯升高(P<0.05)，提示心肌肥厚造模成功(圖1A)。接著使用Western Blot檢測AngⅡ誘導組細胞中SH2B1蛋白水平的變化，結果顯示,與對照組相比，AngⅡ組SH2B1的蛋白表達水平上調(圖1 B,C)，差異有統計學意義(P<0.05)。同時， Western Blot檢測AngⅡ誘導組細胞中GLUT4、G6PD蛋白表達水平，結果顯示, 與對照組相比，AngⅡ組GLUT4、G6PD蛋白表達水平增加(圖1 D,E)，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果表明，在AngⅡ誘導心肌肥大過程中，SH2BI表達增加，糖代謝活動增強。

注：A.AngⅡ誘導心肌細胞肥大后ANP、BNP的mRNA相對表達水平；B、C. AngⅡ誘導心肌細胞肥大后SH2B1的電泳圖及比較；D、E. AngⅡ誘導心肌細胞肥大后GLUT4、G6PD的電泳圖及比較。與對照組比較，aP<0.01

1.2 AngⅡ誘導心肌細胞肥大過程中AMPK通路改變 與對照組相比，AngⅡ組AMPK基本不變，而其磷酸化增強，差異具有統計學意義(P<0.05),見圖2。表明在心肌肥大的過程中AMPK信號通路被激活。

注：A. AngⅡ誘導心肌細胞肥大后AMPK、p-AMPK的電泳圖；B. AMPK磷酸化水平的量化比較。與對照組比較，aP<0.01

1.3 下調SH2B1對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大過程中糖代謝的影響 與siNeg組相比，siSH2B1 轉染后其表達量明顯下降(圖3 B,C)，差異具有統計學意義(P<0.05)，即siSH2B1能成功敲低SH2B1的表達。與siNeg+AngⅡ組相比，siSH2BI +AngⅡ組GLUT4、G6PD蛋白表達減少(圖3D,E),差異具有統計學意義(P<0.05)。表明SH2B1表達減少可抑制AngⅡ誘導心肌細胞肥大過程中的糖代謝，減少心肌肥厚程度。

注：A. 心肌細胞肥厚指標ANP、BNP的mRNA相對表達水平；B、C. 轉染siRNA后SH2B1的電泳圖及比較；D、E. 轉染siSH2B1后GLUT4、G6PD的電泳圖及比較。與對照組比較，aP<0.01; 與siNeg組比較，bP<0.05，cP<0.01

1.4 下調SH2B1對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大過程中信號通路AMPK的影響 與siNeg+AngⅡ組相比，siSH2BI +AngⅡ組AMPK的磷酸化水平減弱(圖4)，差異具有統計學意義(P<0.05)。表明SH2B1表達減低可抑制AMPK信號通路的激活。

注：A. 轉染siSH2B1后AMPK、p-AMPK的電泳圖；B.AMPK磷酸化水平的量化比較。與對照組比較，aP<0.01; 與siNeg組比較，bP<0.01

1.5 抑制AMPK通路對AngⅡ誘導的心肌肥大過程中糖代謝的影響 與對照組相比，AngⅡ組GLUT4、G6PD蛋白表達水平上調(圖5),差異具有統計學意義(P<0.05)；而與AngⅡ組相比，compound C+ AngⅡ組的GLUT4、G6PD蛋白表達減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。表明抑制AMPK通路可減輕AngⅡ誘導的心肌肥大過程中的糖代謝。

注：A. 糖代謝相關蛋白GLUT4、G6PD的電泳圖；B. GLUT4、G6PD水平比較。與對照組比較，aP<0.05; 與AngⅡ組比較，bP<0.01

3 討 論

作為一種接頭蛋白，SH2B1在多種信號傳導過程中發揮重要作用，并且可以調控能量平衡、體質量和糖代謝。以往研究重點多放在其與癌癥的關系，研究發現SH2B1在多種惡性腫瘤中表達異常[6-9]。Liu等[10]研究表明SH2B1在肺癌中高表達，miR-361可以直接靶向肺癌中SH2B1從而抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。近年來，SH2B1在心血管疾病中的研究逐漸增多。肥胖是心血管疾病的獨立危險因素，而SH2B1作為肥胖相關的基因，研究顯示其基因多態性與肥胖和非酒精性脂肪肝患者的脂肪變性的嚴重程度密切相關[11]。Wu等[12]的研究直接揭示了SH2B1在壓力超負荷下通過激活JAK2/STAT3信號通路發揮促心肌肥厚的作用。Liu等[10]發現miR-142-3p能直接作用于SH2B1來改善病理性心肌肥厚并調控線粒體功能。然而，SH2B1是否參與病理性心肌肥厚代謝重編程的發生發展目前尚不清楚。本研究證實AngⅡ刺激乳鼠心肌細胞后，與對照組相比，SH2B1的蛋白表達水平增加，推測SH2B1的高表達可能與心肌肥厚的發生發展相關。使用siRNA沉默SH2B1時，SH2B1蛋白表達量明顯減少，提示siRNA轉染效果好。轉染siRNA48 h后，與AngⅡ組相比，siSH2B1+ AngⅡ組的心肌肥厚標志物ANP、BNP顯著下降，這與既往報道一致。

在心肌肥厚進展過程中，心臟更加偏好糖酵解供能，發生能量代謝重編程[13]。一方面將葡萄糖作為底物，能量利用效率更高，另一方面，糖酵解速率提升的同時生成了更多的質子以及乳酸，而酸性環境將進一步損傷心肌細胞[14]。目前普遍認為這種心肌燃料代謝的異常促進了心肌肥厚和心力衰竭的發展[15]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AMPK被稱作能量代謝的總開關，在糖代謝中發揮重要作用[16]。本研究中通過AngⅡ構建心肌細胞肥大模型，發現在心肌肥厚過程中，糖酵解活動增強，而且伴隨著 “能量傳感器”AMPK的活化，GLUT4、G6PD蛋白表達也上調。而在一項新的研究中，APMK的強效變構激活劑MK-8722能誘導持久的葡萄糖攝取和糖原合成，并且給藥1個月后，大鼠出現心臟重量增加并觀察到與心臟糖原增加相關聯的心臟肥大[17]。

SH2B1作為內源性瘦素增敏劑，可增強瘦素的敏感性[18]。瘦素刺激JAK2的Tyr813位點使其自磷酸化[19]。而SH2B1通過其SH2結構域與自磷酸化Tyr813位點結合，顯著增強JAK2活性，從而促進JAK2下游瘦素信號通路的激活[19]。2002年，Barbara Kahn的實驗室首次闡明AMPK在介導瘦素作用中扮演的關鍵角色，證明在骨骼肌中瘦素激活AMPK從而調控脂肪酸代謝。而最近研究發現瘦素可以調控脂肪細胞的分化及米色脂肪轉化，這依賴于APMK信號通路的激活[20]。由此筆者推測SH2B1或許可以通過調控AMPK信號通路調節能量代謝過程。在本研究中，下調SH2B1的表達后，AMPK、GLUT4、G6PD蛋白水平顯著降低，提示沉默SH2B1可能抑制AMPK磷酸化，GLUT4、G6PD蛋白表達。而使用AMPK抑制劑compound C能達到與沉默SH2B1類似的效果，由此我們推測沉默SH2B1可能抑制了其對AMPK信號通路的激活作用，從而導致心肌細胞肥大過程中糖酵解活動的下降，起到心臟保護作用。

總之，本研究表明，SH2B1可以通過AMPK介導的GLUT4促進葡萄糖攝取，和G6PD促進糖酵解中間產物的分解代謝，從而增加糖酵解通量。這一研究揭示了以前從未被認識的SH2B1與心肌肥厚中能量代謝重編程之間的關系，為臨床治療病理性心肌肥厚提供新的靶點。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

毛帥：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；王順：完善研究方案；顏輝、楊曼琪：分析試驗數據；吳鋼：提供研究方向，論文審核