一株豬源豕鏈球菌的分離鑒定

邵 季 王志成 張 欣 羊 揚＊

（1.揚州大學獸醫(yī)學院/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州225009；2.揚州大學動物疾病檢測與技術服務中心，江蘇 揚州225009）

作為革蘭氏陽性菌，鏈球菌在自然界中的分布十分廣泛，有莢膜，多呈雙球或短鏈形，單球菌也時常被發(fā)現(xiàn)。鏈球菌科不僅包含鏈球菌屬，還包括乳球菌屬。根據(jù)蘭氏分類法，鏈球菌屬被分成了20多種血清型，豬鏈球菌與豕鏈球菌都屬于鏈球菌屬，二者在生長形態(tài)上非常相似，細菌經(jīng)革蘭氏染色后，在光學顯微鏡下均呈現(xiàn)革蘭氏陽性球菌形態(tài)，其在血瓊脂平板上，呈現(xiàn)明顯的β溶血。然而，盡管生長特型與形態(tài)相似，兩者的毒力與致病力之間存在較大差異。

豕鏈球菌可以發(fā)揮人源與豬源致病作用，能對公共衛(wèi)生安全造成一定影響，應當引起相關重視[1-4]。

2018年12月，揚州大學動物疾病檢測與技術服務中心對江蘇省東臺市溱東鎮(zhèn)送檢的一例咽喉水腫、腦膜出血的病死豬進行檢測，采集咽喉扁桃體，分離出一種菌株，該菌株顯示出懷疑是豬鏈球菌的明顯β溶血現(xiàn)象。為進一步確證該菌，本實驗擬通過分子生物學手段及生化試驗手段，對所分離疑似豬鏈球菌菌株進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料的分離培養(yǎng)

于血瓊脂平板上，接種從送檢死豬病料上無菌采集的心、脾、淋巴、扁桃體等組織，37℃培養(yǎng)16至24 h，挑取β溶血明顯、表明光滑的菌落，進行后續(xù)試驗。

1.2 生化試驗

按照鏈球菌菌株的生化指標進行生化培養(yǎng)管鑒定，挑取純化后的菌落，將菌株接種至生化管，37℃培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果。

1.3 全自動快速生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)分析

將分離菌純化培養(yǎng)，獲取單菌落，在生物安全柜中涂布到MALDI靶板上，使其自然干燥；干燥后滴加70%甲酸溶液1μL，使其自然干燥；最后加入基質(zhì)溶液1μL，使其干燥后，放入全自動生物質(zhì)譜儀中，進行檢測。

1.4 16s rDNA鑒定

利用16s rDNA法對菌株進行分型鑒定。單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)；取1mL菌液離心，pdw水洗滌，100μL滅菌超純水重懸；煮沸5分鐘后離心，將上清液用作隨后的PCR實驗的模板。對菌株的16s rDNA通過PCR方法進行擴增，由南京擎科生物科技有限公司對擴增的產(chǎn)物進行基因測序。在GenBank中進行Blast分析，獲取本次測序的結(jié)果。

1.5 藥敏試驗

在超凈臺中用接種環(huán)挑取純化培養(yǎng)后單菌落，平板劃線布滿整塊平板，分別貼上相應藥敏紙片，并在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.6 耐藥基因及毒力基因檢測

根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫序列及參考文獻報道，首先通過PCR方法，對相應基因進行擴增，設計合成共4對毒力基因引物。同時設計10對引物，對細菌相應耐藥基因進行擴增檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。耐藥基因含其中ESBLs類3種，氨基糖胺類3種，喹諾酮類2種，頭孢類2種；毒力基因含豕鏈球菌重要毒力因子紅疹毒素A、B、C及鏈球菌溶血素O相應基因speA、speB、speC、slo。

1.7 小鼠攻毒試驗

ICR小鼠分為4組，陰性對照組1只腹腔注射0.1mL生理鹽水，其余三組各3只，按不同劑量稀釋菌液每組腹腔注射0.1mL菌液（濃度分別為105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL），觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離

該分離物被革蘭氏染色，表現(xiàn)為具有清晰鏈排列的革蘭氏陽性細菌。在血平板上形成針尖大小、透明的β溶血菌落。

2.2 生化試驗

該菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖等，MAG、PYR反應陽性，DPP、PMG、TMZ、精氨酸為陰性。

2.3 細菌鑒定

細菌16srDNA序列經(jīng)PCR擴增，切膠回收后送南京擎科公司測序。序列經(jīng)Genbank比對后，與數(shù)據(jù)庫中豕鏈球菌具有99%同源性，與豬鏈球菌2型同源性為92%。隨后對分離菌進行全自動快速生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)分析，經(jīng)鑒定為豕鏈球菌。

2.4 藥敏試驗

通過藥敏紙片法，對分離菌進行耐藥性檢測，該分離菌對氯霉素、慶大霉素等抗生素敏感，而對氨芐西林、頭孢他啶、氨曲南等耐藥，具體結(jié)果見表1。

表1 耐藥性試驗結(jié)果

2.5 耐藥基因及毒力基因擴增

對分離菌株進行耐藥基因擴增，TEM基因檢出陽性。對分離菌株4種毒力基因進行PCR擴增，均為陰性。

2.6 小鼠攻毒試驗

試驗組小鼠在注射分離菌懸液后未出現(xiàn)明顯癥狀，與對照組在一周觀察時間內(nèi)無差異。

3 討論

本病例中，送檢病死豬呈咽喉水腫、腦膜出血，通過細菌學檢查、生化鑒定初步判定為鏈球菌感染。分子生物學技術的發(fā)展將鏈球菌屬分類由21種增至89種，之前尚未被分離或分類為鏈球菌的鏈球菌屬的新成員已被重命名和定位。為進一步鑒定該分離菌種類，本研究隨后對臨床分離菌株進行分子學分析及質(zhì)譜分析。

通過16s rDNA方法及質(zhì)譜檢驗，臨床分離和懷疑的鏈球菌菌株被鑒定為豕鏈球菌。 豕鏈球菌和豬鏈球菌的形態(tài)相似，盡管具有相似的生長特性，但致病性差異很大。豬鏈球菌病不僅對生豬的生產(chǎn)造成巨大損害，而且對人也有致病作用，是一種嚴重的人畜共患細菌感染性疾病；而國際上，對豕鏈球菌毒力的研究主要集中于人與豬，國內(nèi)則報道了牛源感染病例。

通過藥敏紙法對分離出的細菌進行耐藥性測試，結(jié)果表明，分離出的細菌對氯霉素、慶大霉素等抗生素敏感，但對氨芐西林、頭孢他啶和氨曲南具有耐藥性。對分離菌10種耐藥基因進行檢測，ESBLs類TEM基因為陽性，與藥敏紙片結(jié)果相對應。

隨后對豕鏈球菌重要毒力因子紅疹毒素A、B、C及鏈球菌溶血素O基因speA、speB、speC、slo進行檢測，4種毒力基因均未檢出。本菌可能通過其他毒力因子發(fā)揮人源致病作用。

本次研究的結(jié)果表明，盡管分離的鏈球菌對豬致病性較弱，但它可以存在于豬中，并有可能成為繼發(fā)感染的病原體，應引起更多關注。豕鏈球菌對公共衛(wèi)生安全能造成一定影響，在生產(chǎn)過程中，應注意工作人員的防護，避免交叉感染。