GSH對(duì)鉛脅迫下多年生黑麥草生長(zhǎng)及光合生理的影響

趙利清，彭向永，劉俊祥，毛金梅，孫振元*

（1.國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京100091；2.國(guó)家開放大學(xué)，北京100039；3.曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜273165；4.新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所，新疆 烏魯木齊830063）

鉛（Pb）與汞（Hg）、鎘（Cd）、鉻（Cr）、砷（As）并稱“五毒”重金屬，廣泛分布于環(huán)境之中［1－2］。Pb可以通過植物根系的Ca2+通道或葉表皮的角質(zhì)層小孔、氣孔器和排水器等進(jìn)入植物體內(nèi)，Pb在植物體內(nèi)不能被降解［3－4］，累積的Pb會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害，如膜脂過氧化、酶失活、干擾礦質(zhì)元素吸收及抑制光合作用等［5－8］。光合作用是環(huán)境脅迫最為敏感的生理過程［9］，Pb脅迫能夠使植物氣孔關(guān)閉、葉綠體結(jié)構(gòu)受損、卡爾文循環(huán)中的酶失活、光合色素合成和電子傳遞受阻等，最終抑制植物生長(zhǎng)或?qū)е滤劳觯?0］。因此亟待找到一種緩解Pb毒害的方法。

由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的活性三肽－谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH），在重金屬解毒方面發(fā)揮了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)枸杞谷胱甘肽合成酶基因（LcGS）的煙草（Nicotiana tabacum），在Cd脅迫下，GSH、植物螯合肽（phytochelatins，PCs）和葉綠素含量明顯高于對(duì)照，對(duì)鎘的抗性顯著增加［11］。外源GSH能夠增加植物的內(nèi)源GSH含量，降低活性氧（reactive oxide species，ROS）含量，使抗氧化酶活性和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性增加，植物對(duì)Zn、Cd和Gu的耐受性增強(qiáng)［12－18］。相反，谷胱甘肽合成酶抑制劑丁硫氨酸－亞砜亞胺（L-Buthioninesulfoximine，BSO）能夠抑制谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性，使植物體內(nèi)GSH和PCs含量減少，抗性降低［19－20］。目前，對(duì)GSH緩解植物重金脅迫的研究主要集中在Cd脅迫下抗氧化酶活性和細(xì)胞膜穩(wěn)定性等方面，對(duì)Pb脅迫下光合作用的研究至今未見報(bào)道。

本研究以多年生黑麥草（Lolium perenne）為材料，設(shè)定CK、Pb、Pb+GSH和Pb+BSO 4個(gè)處理，測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)、光合色素含量、光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)，研究GSH對(duì)Pb脅迫下多年生黑麥草生長(zhǎng)及光合作用的影響，以探討GSH對(duì)Pb毒害的緩解效果和生理機(jī)制，為進(jìn)一步闡明GSH解毒重金屬脅迫機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 幼苗的培養(yǎng)

多年生黑麥草種子購(gòu)自京東網(wǎng)“芳之葵”農(nóng)資專營(yíng)店，品種為‘卡特’（L.perenne‘cuttle’）。2018年5月將種子均勻地撒播于裝滿營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，常規(guī)養(yǎng)護(hù)管理。培養(yǎng)6周后，選生長(zhǎng)一致的植株，洗凈根部泥土，定置于盛有9 L 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)盆中繼續(xù)培養(yǎng)6周，營(yíng)養(yǎng)液pH調(diào)為6.0，每盆3株，期間每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液并利用充氣泵連續(xù)充氣。

1.2 試驗(yàn)處理

通過前期試驗(yàn)篩選Pb處理濃度，用0、0.50、0.75、1.00、1.50 mmol·L－1Pb（NO3）2根部處理12周大幼苗，處理1周。選擇膜透性、可溶性蛋白和生長(zhǎng)高度出現(xiàn)顯著差異的最低濃度0.75 mmol·L－1作為處理濃度。并且根據(jù)文獻(xiàn)［21－22］確定GSH和BSO的處理濃度。

試驗(yàn)共設(shè)CK、Pb、Pb+GSH和Pb+BSO 4個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。Pb（NO3）2直接加入營(yíng)養(yǎng)液中，為避免Pb2+與營(yíng)養(yǎng)液中的H2PO4－反應(yīng)產(chǎn)生沉淀降低Pb效應(yīng)，處理營(yíng)養(yǎng)液采用無(wú)KH2PO4的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，通過每盆噴施1次20 mL的0.2%的KH2PO4溶液補(bǔ)充磷和鉀元素。GSH和BSO采用葉面噴施法，噴施蒸餾水、GSH和BSO間隔0.5 h，待前者充分吸收后，再噴施后者。每天上午噴施1次，連續(xù)處理1周，處理期間利用充氣泵持續(xù)充氣。具體如下：CK）：1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，噴50 mL蒸餾水；Pb）：含0.75 mmol·L－1Pb（NO3）2的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，噴50 mL蒸餾水；Pb+GSH）：含0.75 mmol·L－1Pb（NO3）2的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，先噴25 mL蒸餾水，再噴施25 mL 10 mmol·L－1GSH；Pb+BSO）：含0.75 mmol·L－1Pb（NO3）2的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，先噴25 mL蒸餾水，再噴施25 mL 1 mmol·L－1BSO。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 莖葉、根長(zhǎng)和分蘗數(shù)的測(cè)定 莖葉和根長(zhǎng)：用刻度尺測(cè)量每一單株中最長(zhǎng)的莖葉和根，測(cè)定3株，取平均值，精確到0.1 cm。分蘗數(shù)：以每穴（包括主莖）全部分蘗來(lái)統(tǒng)計(jì)多年生黑麥草的分蘗數(shù)［23］。

1.3.2 生物量的測(cè)定 用自來(lái)水沖洗植株去除表面粘附物，然后用10 mmol·L－1Na2-EDTA浸泡吸附根系表面附著的Pb2+，再用去離子水洗凈，吸干水分，稱鮮重后于105℃殺青30 min，75℃下烘干至恒重，稱干重［24］，以每穴為單位分別計(jì)算多年生黑麥草莖葉和根的生物量。根冠比=根干重/莖葉干重。

1.3.3 光合色素含量的測(cè)定 取多年生黑麥草成熟葉片0.25 g，80%丙酮提取，用分光光度計(jì)測(cè)定663、645和470 nm波長(zhǎng)的吸光值［24］，并以Arnon（1949）法計(jì)算葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量。

1.3.4 光合參數(shù)的測(cè)定 選生長(zhǎng)良好的成熟葉片，于上午9：00－11：00用CIRAS-2型便攜式光合儀（英國(guó)）測(cè)定多年生黑麥草的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）及蒸騰速率（Tr）。試驗(yàn)中所用光源為白熾燈，葉室溫度自動(dòng)調(diào)控，供氣氣體流速200 mL·min－1，大氣CO2濃度450 μmol·mol－1，自動(dòng)記錄，間隔時(shí)間3 s。

1.3.5 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 植株在暗室中適應(yīng)30 min后，用Handy PEA（Plant Efficiency Analyser；Hansatech Instrument Ltd.，UK）測(cè)定葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)，測(cè)定光源為650 nm的紅光，光照強(qiáng)度為2500 μmol·m－2·s－1的飽和光強(qiáng)，熒光信號(hào)的記錄時(shí)程為2 s，解析從葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線中得到的主要熒光參數(shù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)定3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)P＜0.05水平上的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH對(duì)Pb脅迫下多年生黑麥草莖葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)及分蘗的影響

與對(duì)照組比較，Pb處理下多年生黑麥草莖葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)和分蘗數(shù)分別顯著降低了36.7%、41.9%和37.3%（P＜0.05）。Pb+GSH處理下，莖葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)和分蘗數(shù)較Pb處理組均顯著增加，但仍然顯著低于對(duì)照。與Pb處理組比較，Pb+BSO處理下，莖葉長(zhǎng)略微增加，根長(zhǎng)和分蘗數(shù)稍有下降，但均無(wú)顯著差異（圖1）。

圖1 外源GSH和BSO誘導(dǎo)Pb脅迫下多年生黑麥草的莖葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)及分蘗數(shù)Fig.1 Shoot length，root length and tiller number of perennial ryegrass induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.2 GSH對(duì)Pb脅迫下多年生黑麥草生物量的影響

與對(duì)照組比較，Pb處理下多年生黑麥草莖葉鮮重、干重、根的鮮重和干重及根冠比分別顯著降低了52.1%、37.9%、65.7%、41.7%和7.3%（P＜0.05）。Pb+GSH處理下，較Pb處理組的莖葉鮮重、干重和根的鮮重、干重以及根冠比均顯著提高，但除了根冠比之外，其他指標(biāo)仍顯著低于對(duì)照組。Pb+BSO處理較Pb處理組，莖葉鮮重和干重以及根干重均顯著下降，但根冠比顯著升高。這表明Pb脅迫抑制了植物的生長(zhǎng)，而且對(duì)根的抑制大于莖葉，噴施GSH能夠緩解Pb對(duì)多年生黑麥草生長(zhǎng)的抑制作用，BSO則加劇了Pb的抑制作用（表1）。

表1 外源GSH和BSO誘導(dǎo)Pb脅迫下多年生黑麥草的生物量及根冠比Table 1 Plant biomass and root-shoot ratio of perennial ryegrass induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.3 GSH對(duì)Pb脅迫下多年生黑麥草光合色素的影響

Pb處理下，多年生黑麥草葉片葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量較對(duì)照分別下降了8.6%、12.2%和9.6%，均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。Pb+GSH處理較Pb處理組，葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均顯著增加。Pb+BSO處理下，類胡蘿卜素的含量顯著低于Pb處理組（表2）。

表2 外源GSH和BSO誘導(dǎo)Pb脅迫下多年生黑麥草的葉片光合色素含量Table 2 Photosynthetic pigment content of perennial ryegrass leaf induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.4 GSH對(duì)Pb脅迫下多年生黑麥草光合參數(shù)的影響

Pb、GSH和BSO處理下多年生黑麥草葉片光合參數(shù)發(fā)生了不同的變化，單一Pb處理下，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度比對(duì)照分別顯著降低了64.3%、51.5%和67.0%，胞間二氧化碳濃度顯著增加了5.2%（P＜0.05）。Pb+GSH處理下，較Pb處理組，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度均顯著增加。Pb+BSO處理下，較Pb處理組，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這表明Pb脅迫抑制了多年生黑麥草的光合作用，外源GSH可緩解Pb脅迫作用，而BSO具有與GSH相反的功能（表3）。

表3 外源GSH和BSO誘導(dǎo)Pb脅迫下多年生黑麥草的葉片光合參數(shù)Table 3 Photosynthetic parameters of perennial ryegrass leaf induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

2.5 GSH對(duì)Pb脅迫下多年生黑麥草葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

單一Pb脅迫下，F(xiàn)o、Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo和PIABS較對(duì)照組均顯著降低（P＜0.05），下降幅度最大的是PIABS，達(dá)到35.98%，最小的是Fv/Fm，只有1.93%，這表明Pb對(duì)植物的整體性能影響最大。Pb+GSH處理下，各項(xiàng)指標(biāo)較Pb處理都有所增加，增幅最大的是PIABS，為26.1%。Pb+BSO處理下，與Pb處理組相比，各項(xiàng)指標(biāo)變化趨勢(shì)不統(tǒng)一，但均沒有顯著差異（表4）。

表4 外源GSH和BSO誘導(dǎo)Pb脅迫下多年生黑麥草的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Chlorophyll fluorescence kinetic parameters of perennial ryegrass leaf induced by exogenous GSH and BSO under Pb stress

3 討論

植物的生長(zhǎng)狀態(tài)可以直接反映出受脅迫的程度，因此是評(píng)估抗逆性的重要指標(biāo)［25］。前人研究表明，Pb脅迫下植物株高和生物量降低，分蘗數(shù)減少，生長(zhǎng)受到抑制［7，26－27］。同樣，Pb脅迫下多年生黑麥草的莖葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、分蘗數(shù)和生物量均顯著降低，噴施GSH后，莖葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、分蘗數(shù)和生物量都顯著增加，這可能是GSH調(diào)節(jié)光合作用，誘導(dǎo)生長(zhǎng)素合成酶基因的表達(dá)，保證了部分細(xì)胞正常分裂，緩解Pb脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制［16，28］。相反，Pb脅迫下多年生黑麥草噴施BSO后，根長(zhǎng)、分蘗數(shù)和生物量都呈下降趨勢(shì)，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制，這與在東南景天（Sedum alfredii）上的研究結(jié)果相符［29］。

葉綠素負(fù)責(zé)光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換，是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)［30］。重金屬離子能夠取代植物葉綠體蛋白質(zhì)中的Fe2+、Zn2+、Mg2+或與功能基團(tuán)－SH結(jié)合，致使葉綠體蛋白中心離子組成發(fā)生改變而失活，導(dǎo)致葉綠素含量和光合能力下降［31］，本研究與前人報(bào)道一致，Pb處理下多年生黑麥草葉綠素含量顯著降低。外源GSH能夠增加Cd、Cu脅迫下水稻（Oryza sativa）和海洲香薷（Elsholtzia haichowensis）的葉綠素含量［15，32］，本研究中GSH處理后，多年生黑麥草葉綠素含量顯著增加，可能是由于外源GSH降低了Pb與SH結(jié)合或?qū)θ~綠素中心離子的取代，保護(hù)了光合電子鏈中酶的活性，從而保證了葉綠素的合成。

類胡蘿卜素除了具有吸收和傳遞光能功能外，還可以猝滅激發(fā)態(tài)的葉綠素，避免吸收多余的能量對(duì)光系統(tǒng)造成傷害［33］。低濃度重金屬促進(jìn)小白菜（Brassica chinensis）類胡蘿卜素的合成，相反，高濃度能抑制其合成［34］。Pb處理后多年生黑麥草類胡蘿卜素沒有顯著變化，可能是由于植物種類和處理濃度不同的原因。GSH處理后也沒有顯著變化，而BSO處理后顯著低于Pb處理，這證明了當(dāng)類胡蘿卜素處于正常水平時(shí)，增加GSH對(duì)其合成沒有促進(jìn)作用，而減少GSH會(huì)嚴(yán)重影響合成。

氣孔限制和非氣孔限制是導(dǎo)致Pn降低的兩個(gè)因素，Pn、Gs和Ci同時(shí)下降是氣孔因素影響，否則是非氣孔因素［24］。本研究中Pb脅迫下Pn、Gs下降，而Ci升高，說(shuō)明多年生黑麥草Pn下降是非氣孔因素引起的，這與前人在紫穗 槐（Amorpha fruticosa）上 的 研 究 結(jié) 果 一 致［35］。Wang等［36］研 究 發(fā) 現(xiàn) 外 源GSH能 夠 緩 解 鎘 對(duì) 兩 種 大 麥（Hordeum vulgare）Pn的抑制，同樣，多年生黑麥草噴施GSH后Pn也顯著增加。噴施BSO后Pn降低，與Mariana等［20］在大豆（Glycine max）上的研究結(jié)果一致。

與“表觀性”的氣體交換參數(shù)相比，葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)可更靈敏地反映出植物葉片光合機(jī)構(gòu)性能的變化［37］。本 研 究 中，Pb脅 迫下多年生黑 麥 草 葉 片F(xiàn)o、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm及PIABS均 顯 著下降，類 似 結(jié) 果 在 百 喜草（Paspalum notatum）上也得到了證實(shí)［38］。Fo下降表明捕光天線系統(tǒng)受到了損傷［39］，F(xiàn)m、Fv/Fm的下降表明光合電子傳遞能力和反應(yīng)中心內(nèi)光能轉(zhuǎn)換效率下降。Fv/Fo和PIABS的下降意味著PSⅡ的潛在活性和整體性能都在下降。Pb脅迫后噴施GSH，增加了PIABS，表明GSH能夠提高多年生黑麥草PSⅡ的整體性能，究其原因，可能與葉綠素含量變化相關(guān)。

4 結(jié)論

Pb脅迫降低了多年生黑麥草葉綠素含量，損傷了捕光天線系統(tǒng)，阻礙了光合電子傳遞和光能轉(zhuǎn)換，從而降低了Pn，影響了光合作用，最終抑制了植物的生長(zhǎng)；外源噴施GSH能夠緩解多年生黑麥草Pb脅迫作用，而BSO具有與GSH相反的功能，加劇了Pb脅迫的傷害。