腦脊液細胞因子在帕金森病和非典型帕金森綜合征鑒別診斷中的價值☆

夏丹豪 項志 付雨 鄭倩藝 王玖琦 滕軍放

帕金森病（Parkinson disease，PD）患者存在運動遲緩、肌強直和靜止性震顫等癥狀[1]，非典型帕金森綜合征（atypical parkinsonism，AP）包括多系統萎縮（multiple system atrophy,MSA）、進行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy,PSP）等[2]，與PD臨床特征相似，尤其在疾病早期，給診斷帶來了一定困難。因此，需要特定標志物幫助醫生對此類患者進行更及時、準確的診斷。盡管PD和不同AP的病因未知，但腦實質炎癥可能參與病程[3]，PD、MSA和PSP患者尸檢均發現小膠質細胞激活[4-6]。已在腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中檢測到了由類淋巴系統等通路[7-8]進入的小膠質細胞源性細胞因子[9-10]。本研究評估了PD、MSA、PSP和對照組CSF細胞因子譜差異，并探討其在疾病鑒別診斷中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2018年4月到2019年12月我院神經內科收治的34例PD患者、18例MSA患者和23例PSP患者為研究對象，見表1。所有診斷均由兩名經驗豐富的神經內科主任醫師完成，并使用修正Hoehn-Yahr（H-Y）分級量表對患者病情嚴重程度進行評估。納入標準：①PD的診斷參考國際帕金森和運動障礙協會（International Parkinson and Movement Disorder Society，MDS）2015年制定的原發性PD診斷標準完成[11]，MSA的診斷參考第二版的統一專家診斷共識及《多系統萎縮診斷標準中國專家共識》完成[12-13]，PSP的診斷參考2015年MDS制定的PSP診斷標準完成[14]；②能完成本研究量表評估及臨床指標水平檢測。另納入同時間段來本院體檢健康人員29名為對照組，簽署知情同意書后于神經內科病房抽取CSF標本。排除標準：①較嚴重的頭顱外傷史和手術史；②伴有嚴重心血管、肝腎疾病；③精神病史、認知功能障礙者；④由藥物或腦血管疾病誘發的帕金森病；⑤老年性、癔癥性或緊張性震顫患者；⑥伴有免疫系統疾病；⑦神經系統腫瘤、感染等器質性病變及腦血管疾病者；⑧長期使用非甾體抗炎藥物、糖皮質激素類藥物治療。本研究經過醫院倫理委員會審核批準，且研究對象均知情同意。

1.2 CSF標本收集通過腰椎穿刺獲取研究對象的CSF，立即在 4℃以2000 r/min離心10 min，將上清液等量分裝到400 μL無菌聚丙烯試管中，儲存在-80℃。從腰椎穿刺開始獲取CSF標本到標本凍存的時間控制在60 min以內。

1.3 細胞因子測定采用酶聯免疫吸附測定試劑盒 （購自伊萊瑞特或欣博盛生物科技有限公司）并嚴格按照試劑盒使用說明書檢測所有研究對象CSF細胞因子水平，包括C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、白介素（interleukin，IL）-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-18、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、干擾素（interferon，IFN）-γ 和轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β。每位研究對象的樣本重復測3次，結果取平均值。

1.4 統計學方法采用SPSS 25.0、GraphPad Prism 8和MedCalc 19.0進行統計學分析。計量資料若為正態分布以±s表示，若為非正態分布以M（QL,QU）表示。多組間比較采用單因素方差分析或非參數秩和檢驗，兩兩比較相應采用LSD-t法或Dunn法。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析各細胞因子，ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）表示其統計學效能（0.5＜AUC＜0.7為診斷準確性較低；0.7＜AUC＜0.9為診斷準確性尚可；0.9＜AUC為診斷準確性較高）。使用logistic回歸模型確定鑒別診斷的最佳細胞因子組合。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 一般資料PD、PSP、MSA組和對照組四組間平均年齡、性別及修正H-Y分級評分比較，無統計學差異（P＞0.05）。見表 1。

表1 各組一般資料對比

2.2 CSF細胞因子水平比較四組研究對象CSF細胞因子水平見表 2。PSP組的 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-4和 IL-6水平較 PD組高；MSA組與PD組的各細胞因子水平無統計學差異；與對照組相比，PD組只有IL-4水平顯著降低；PSP組的IFN-γ和IL-1β水平顯著升高；MSA組所有細胞因子水平無統計學差異。各組間IL-10、IL-18和TGF-β水平均無統計學差異。

表2 各組CSF細胞因子水平（pg/mL）

2.3 細胞因子水平用于鑒別PD與AP的ROC曲線分析用ROC曲線分析細胞因子，以評估其鑒別各組患者的能力。當PD組與PSP組進行比較時，單個細胞因子中鑒別能力最強的是IL-4，AUC為0.79，IL-4低于截斷值提示PD可能，敏感度為94.12%，特異度為 52.17%。此外 CRP、TNF-α、IL-1β和IL-6低于各自截斷值也提示PD可能（表3，圖1A，AUC＜0.7的數據未顯示）；在MedCalc軟件中通過建立logistic回歸方程探索PD組與PSP組鑒別診斷的最佳細胞因子組合，最終納入IFN-γ（X1）和 IL-4（X2）作為協變量，模型表達式為：logit（P）=2.52+5.63X2-2.65X2。將原始協變量X1和X2擬合成聯合預測因子Pre 1，其對應AUC為0.88（表3，圖 1B，P＜0.01，95%CI：0.77～0.95），Pre 1 大于截斷值提示PD可能，敏感度為91.18%，特異度為82.61%。

表3 各指標以及聯合檢測對PD組和PSP組的鑒別診斷效能

當PD組與MSA組進行比較時，單個細胞因子中鑒別能力最強的是IL-4，AUC為0.74，IL-4低于截斷值提示PD可能，敏感度為47.06%，特異度為94.44%。此外CRP低于截斷值也提示PD可能（表 4，圖 1C，AUC＜0.7 的數據未顯示）；同樣建立logistic回歸方程探索PD組與MSA組鑒別診斷的最佳細胞因子組合，最終納入 IFN-γ（X1）、IL-1β（X2）和 TGF-β（X3）作為協變量，模型表達式為：logit（P）=-10.04+7.57X1-5.25X2+0.01X3。將原始協變量X1、X2和X3擬合成聯合預測因子Pre 2，其對應 AUC 為 0.96（表 4，圖 1D，P＜0.01，95%CI:0.86～0.99），Pre 2大于截斷值提示PD可能，敏感度為88.24%，特異度為94.44%。

圖1 各指標ROC曲線 A為PD組與PSP組單個細胞因子的ROC曲線，B為PD組與PSP組聯合細胞因子的ROC曲線，C為PD組與MSA組單個細胞因子的ROC曲線，D為PD組與MSA組聯合細胞因子的ROC曲線。

表4 各指標以及聯合檢測對PD組和MSA組的鑒別診斷效能

3 討論

在本研究中，與對照組相比，PD組IL-4顯著減少。IL-4可誘導M2型小膠質細胞，與炎癥抑制、免疫調節和組織修復等過程相關[15]，因此PD患者IL-4減少可能會加重神經元損傷。PD組與對照組其余細胞因子均無統計學差異。先前文獻報道，與對照組相比PD患者CSF的IL-1β和TNF-α水平上調[16]。然而也有文獻發現二者CSF的TNF-α水平無差異[17]。這可能與不同研究納入對象的差異有關。MSA組與PD組或對照組相比，各細胞因子均無統計學差異，與先前的文獻報告一致[18-19]。

與 PD 組相比，PSP組 CSF中 CRP、IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α的水平顯著升高。PD和MSA的病理特征均是神經系統中異常聚集的α-突觸核蛋白包涵體，前者包涵體位于神經元中[20]，而后者包涵體則位于少突膠質細胞[21]。不同于PD和MSA，PSP屬于tau蛋白病，神經元和星形膠質細胞中可見病理性tau蛋白包涵體[22]。PSP組患者CSF中細胞因子較PD組與MSA組的高，可能是因為不同疾病病理上的差異導致了炎癥反應及細胞因子的差異。CRP是一種急性期蛋白，在大腦內可以由神經元和神經膠質細胞生成[23-24]，與非運動癥狀如抑郁和癡呆等顯著相關[25-26]。TNF-α和IL-1β是由活化的小膠質細胞表達的促炎性細胞因子，不僅誘導M1型小膠質細胞和維持慢性炎癥[27]，還與tau蛋白的過度磷酸化修飾和神經元丟失有關[28]。此外，研究還發現tau蛋白可以誘導TNF-α和IL-1β的轉錄水平升高[29-30]。IL-6對中樞神經系統的影響是雙向的。海馬細胞經IL-6處理后可通過cdk5/p53等通路誘導tau蛋白的磷酸化來促進神經原纖維纏結形成[31]。在淀粉樣前體蛋白轉基因小鼠中過表達IL-6減少了β-淀粉樣蛋白斑塊的沉積，這可能是由于IL-6誘導M2型小膠質細胞激活，增強了對β-淀粉樣蛋白的吞噬作用[32]。

本研究另一目的是評估所選細胞因子用于鑒別診斷PD與AP的能力。PD與MSA或PSP在疾病的早期常常表現出相似癥狀，準確的診斷將對臨床評估、治療和預后產生深遠的影響。本研究中，利用 CSF中 IFN-γ、IL-1β和 TGF-β鑒別 PD組和MSA組患者敏感度和特異度分別為88.2%和94.4%，IFN-γ和IL-4鑒別 PD組和 PSP組患者敏感度和特異度分別為91.2%和82.6%。雖然腰椎穿刺實施的難度較高，在診治過程中較采血不易被患者接受，然而PHILIPP等[33]的研究發現PD，MSA和PSP患者血清中174種細胞因子僅2種的表達發生明顯變化，并且不能區分疾病。

本研究表明，PD和AP患者CSF中細胞因子水平在早期的臨床鑒別診斷中有重要意義。通過聯合檢測細胞因子，可顯著提高診斷結果的可靠性，有望成為臨床輔助診斷的手段之一。本研究的不足可能在于：①相對較小的樣本量；②診斷“金標準”需要神經病理學證據，可能存在錯誤的臨床診斷。因此，更深入的PD和AP患者CSF細胞因子譜差異及診斷價值評估有待進一步的大樣本量研究。