槐米黃酮的純化和體外抗氧化活性研究

王菲，王晨，朱風(fēng)儀，由佳湄，姚玲瓏，孫玉琪，王戰(zhàn)勇

(遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001)

槐米，別名白槐、槐籽、槐花米，是豆科植物槐的花蕾，在山東、河南、安徽、山西、陜西等地大量生產(chǎn)。槐米中黃酮含量較為豐富，其所含蕓香苷具有降低毛細(xì)血管通透性，減輕脆性以及維護(hù)血管抵抗力等作用[1-3]。此外，黃酮還具有抗氧化、抗菌消炎、抗腫瘤、增免等生物活性，研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有治療人體疾病的藥理作用[4-8]，功能強(qiáng)大，是一種天然健康安全的保健成分。

近年來(lái)，對(duì)黃酮類化合的研究越來(lái)越受到科技工作者的重視，繼而開發(fā)了大量的黃酮保健品及藥品，迎合了不同人群的消費(fèi)需求。不同來(lái)源黃酮會(huì)呈現(xiàn)各自特有的生物活性，本研究選取了資源豐富、黃酮含量較高的，但研究較少的槐米為原料，通過(guò)對(duì)槐米黃酮進(jìn)行聚酰胺柱層析純化處理，研究槐米黃酮純化物的生物活性，為其后續(xù)深入開發(fā)利用提供科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

槐米，遼寧恒生實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg)，色譜純；95%乙醇、鹽酸、過(guò)氧化氫、氫氧化鈉、水楊酸、三氯乙酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉、抗壞血酸、鄰苯三酚、三羥基氨基甲烷、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為分析純；DPPH，生物試劑；聚酰胺(30～60目)。

ALC-1100.2電子天平；All basic分析研磨機(jī)； UV-2600可見(jiàn)分光光度計(jì)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；DUG-9021A電熱恒溫干燥箱；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)；DHL-A電腦恒流泵；BS-100A型自動(dòng)部分收集器。

1.2 槐米總黃酮的提取純化

槐米于50 ℃干燥至恒重，冷卻，粉碎，過(guò)40目篩，裝瓶待用。

稱取一定質(zhì)量槐米粉末，加入一定量乙醇溶液和一定濃度的SDS，搖勻，經(jīng)過(guò)400 W超聲處理、水浴一定時(shí)間，離心，上清即為槐米黃酮粗提液。配制一定質(zhì)量濃度和pH的槐米黃酮上樣液，控制吸附流速和上樣量進(jìn)行上樣，用蒸餾水淋洗，再用一定濃度、體積的乙醇按照一定流速進(jìn)行解吸，得到黃酮純化液，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測(cè)定黃酮含量[9]。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.553 4C-0.001 6，R2=0.999 9。 黃酮得率按下面公式計(jì)算：

槐米黃酮得率(mg/g干重)=

1.3 槐米黃酮體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.3.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 0.2 mmol/L的DPPH 2 mL，加入槐米黃酮純化液1 mL，加95%乙醇補(bǔ)至4 mL，混勻靜置。在517 nm波長(zhǎng)，以水為參比，測(cè)量95%乙醇吸光度為Ac，樣品吸光度為AS[10]。

選擇抗氧化能力較好的Vc作陽(yáng)性對(duì)照，以期對(duì)比槐米黃酮的體外抗氧化活性，計(jì)算黃酮與Vc的清除率。

清除率/%=[(Ac-As)/Ac]×100

清除率/%=[(Ac-As)/Ac]×100

1.3.3 清除羥基自由基(·OH)能力的測(cè)定 取1 mL不同濃度槐米黃酮純化液，分別添加1 mL 10 mmol/L FeSO4，1 mL 10 mmol/L 水楊酸-乙醇，加1 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)0.5 h。以去離子水作參比，在510 nm處測(cè)定1 mL去離子水AC和樣品AS[12]。Vc為陽(yáng)性對(duì)照計(jì)算清除率。

清除率/%=[(Ac-As)/Ac]×100

1.3.4 還原力的測(cè)定 取1 mL不同濃度槐米黃酮純化液，依次加入pH 6.6 0.2 mol/L磷酸緩沖液和1% K3Fe(CN)6各2.5 mL混勻，于55 ℃保存20 min，取出，迅速冷卻，加入10%三氯乙酸2.5 mL混合，3 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，加水2.5 mL、0.1% FeCl30.5 mL，充分混合后靜置10 min。以去離子水作參比，于700 nm測(cè)定1 mL去離子水Ac和樣品AS[13]。Vc為陽(yáng)性對(duì)照計(jì)算還原力。

還原力=As-Ac

2 結(jié)果與討論

2.1 槐米黃酮純化條件研究

2.1.1 pH的影響 稱取0.5 g的干聚酰胺樹脂8份，分別放入100 mL三角瓶中，用少量去離子水浸泡4 h，使其達(dá)到飽和，濾掉多余水分，分別加入pH值為1.86,2.73,3.89,4.78,5.63,6.89,7.42,8.56，質(zhì)量濃度為5.22 mg/mL上樣液40 mL，于室溫下振蕩吸附24 h，使其完全均衡，并計(jì)算相應(yīng)吸附量(Q),結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，在pH 6.89時(shí)，聚酰胺對(duì)黃酮吸附量最大，即在pH 6～7之間有較大的吸附效果。這是由于黃酮具有多羥基酚和糖苷鍵結(jié)構(gòu)，使其顯弱酸性，所以在弱酸性環(huán)境中吸附良好。因此，上樣液pH控制在6～7較為合適。

2.1.2 上樣液質(zhì)量濃度的影響 用相同方法處理7份樹脂，將40 mL、pH 6.0、濃度分別為1.33，2.66，3.99，5.22，6.65，7.98，9.31 mg/mL的樣品液分別加入7份樹脂中，操作同上，計(jì)算吸附量(Q)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，吸附率隨黃酮質(zhì)量濃度的增加先增大后減小，在5 mg/mL左右時(shí)吸附率最大，故選擇5 mg/mL為最適上樣液質(zhì)量濃度。

2.1.3 吸附流速的影響 將pH 6.0,5.22 mg/mL上樣液按不同吸附流速0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 mL/min上樣，分別計(jì)算吸附率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，最大吸附率出現(xiàn)在1.0 mL/min處，之后流速過(guò)快，導(dǎo)致吸附不充分，吸附率下降。因此，選擇1.0 mL/min為最佳吸附流速。

2.1.4 上樣量的影響 將pH 6.0,5.22 mg/mL上樣液按柱床體積倍數(shù)1，2，3，4，5 BV進(jìn)行上樣，吸附流速1.0 mL/min，分管收集流出液，測(cè)定其中黃酮濃度，計(jì)算聚酰胺對(duì)槐米黃酮的吸附率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

一般來(lái)說(shuō)，最適上樣量出現(xiàn)在流出液中黃酮質(zhì)量濃度為上樣液中的1/10時(shí)，此時(shí)停止繼續(xù)上樣。由圖4可知，最佳上樣量為1.5 BV。

2.1.5 沖洗水量的影響 將pH 6.0,5.22 mg/mL上樣液按1 mL/min進(jìn)行上樣，用1 BV蒸餾水淋洗，共5次，按柱體積分別收集淋洗流出液，測(cè)定其中黃酮的殘留量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，沖洗水量超過(guò)3 BV時(shí)，流出液基本無(wú)色。因此，選擇3 BV沖洗水量最為合適。

2.1.6 解吸液濃度的影響 將pH 6.0,5.22 mg/mL上樣液按1 mL/min上樣，用3 BV蒸餾水淋洗聚酰胺柱，再用體積分?jǐn)?shù)分別30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%乙醇溶液進(jìn)行洗脫。根據(jù)各階段解吸液中黃酮含量，計(jì)算相應(yīng)解吸率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)解吸率最大。因此，解吸液濃度80%較為合適。

2.1.7 解吸流速的影響 將pH 6.0,5.22 mg/mL上樣液按1 mL/min上樣，3 BV蒸餾水淋洗聚酰胺柱，再用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇分別在1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5 mL/min解吸流速下洗脫，收集解吸液，并測(cè)定黃酮含量，算出相應(yīng)解吸率，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，解吸流速增大，解吸率先升高后下降，在1.5 mL/min達(dá)到最大，故解吸流速以1.5 mL/min 較為適合。

2.1.8 解吸液用量的影響 將pH 6.0,5.22 mg/mL上樣液按1 mL/min上樣，3 BV蒸餾水淋洗聚酰胺柱，再分別用0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5 BV，80%乙醇按1.5 mL/min進(jìn)行解吸，分別收集解吸液，測(cè)定黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知，當(dāng)解吸液超過(guò)4 BV時(shí)，流出液中黃酮濃度顯著減少，說(shuō)明已基本洗脫完全。故為減少溶劑浪費(fèi)，解吸液用量選擇4 BV較合適。

2.1.9 聚酰胺柱使用次數(shù)的影響 在一根聚酰胺樹脂柱上進(jìn)行吸附解吸實(shí)驗(yàn)，計(jì)算每一次的黃酮吸附率，結(jié)果見(jiàn)圖9。

由圖9可知，增加使用次數(shù)，吸附效果逐漸變差。這與雜質(zhì)堵塞樹脂孔隙有關(guān)。當(dāng)使用次數(shù)增加到6次后，吸附率下降趨勢(shì)尤為明顯。因此，聚酰胺柱每用5次就需要再生。

2.2 槐米總黃酮的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 對(duì)·DPPH的清除力 由圖10可知，槐米黃酮對(duì)·DPPH清除效果較Vc略差，但是相較而言，槐米黃酮在600 μg/mL高濃度區(qū)間內(nèi)，對(duì)·DPPH 達(dá)到了87.14%的清除率，也表現(xiàn)出了對(duì)·DPPH 較強(qiáng)的清除效果，但比Vc略差一些。

2.2.3 對(duì)·OH的清除力 由圖12可知，Vc對(duì)·OH 清除率在1 000 μg/mL時(shí)達(dá)到了98.92%，效果非常好。與Vc相比較，槐米黃酮在1 000 μg/mL時(shí)只有34.57%，僅表現(xiàn)出一定的清除力，效果比Vc差些。

2.2.4 還原力 吸光度越大，表明還原能力越強(qiáng)。由圖13可知，槐米黃酮的還原能力與Vc接近。

3 結(jié)論

(1)槐米黃酮最佳純化條件：用5 mg/mL，pH 6～7的槐米黃酮液按吸附流速1.0 mL/min上樣1.5 BV，用3 BV水淋洗，再用5 BV 體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，按1.5 mL/min解吸，效果最佳，樹脂每使用5次后再生。