基于龍牙百合胚拯救技術的植物組織培養綜合實驗教學設計

卻志群， 沈春修， 李潤根， 肖秋生

(宜春學院 生命科學與資源環境學院， 江西 宜春 336000)

植物組織培養是以植物細胞全能性為理論基礎，在無菌和人工控制的環境條件下利用適當的培養基，對離體的植物器官、組織、細胞及原生質體進行培養，使其再生細胞或完整植株的技術[1]。《植物組織培養》是園藝專業的核心課程，該門課程涉及植物學、植物生理學、育種學等多個知識領域并且應用性強、實踐性豐富[2]。為鍛煉學生動手操作能力，使理論知識和實際操作技能有機結合，提高學生創新思維和綜合素質，結合宜春學院生命科學與資源環境學院植物組織實驗課內容單一、綜合性實驗偏少的現狀，特開設龍牙百合胚拯救技術植物組織培養綜合實驗。龍牙百合在宜春市萬載縣有500多年的種植歷史，是當地主栽品種之一，但如今存在品種退化、病害發生嚴重等問題[3]，亟待培育優良的百合新品種。常規雜交由于百合親和性的影響導致后代存活率差異很大，胚拯救技術是克服受精后障礙的主要方法[4-5]。筆者所在教學團隊前期通過胚拯救技術解決了龍牙百合和蘭州百合遠緣雜交受精后障礙，成功獲得雜種苗[6-7]，并將其設計成植物組織培養課程綜合實驗項目。現將基于龍牙百合胚拯救技術的植物組織培養綜合實驗教學設計介紹如下，以期為植物組織培養及相近課程實驗教學提供參考。

1 實驗教學目的

通過實驗課程掌握胚拯救技術的具體操作方法，定期觀察胚萌發情況，統計雜種胚萌發率，分析不同激素配比對胚萌發的影響，探討胚拯救技術的適用領域，提出自己的看法，能自行設計實驗解決生產上面臨的實際問題。

2 教學實施

2.1 實施對象

在宜春學院生命科學與資源環境學院2017級園藝專業32名學生中，以小組的形式開展該綜合實驗項目，每組4人，共8組。本項目課時10學時，其中理論講解2學時，培養基配制與滅菌4學時，胚拯救接種操作4學時。

2.2 教學安排

綜合實驗安排在《植物組織培養》課程授課學期，開課第10～11周時學生對該課程的理論、基本操作已熟悉。采用翻轉課堂[8]的教學模式，教師在第8周通過超星學習通平臺發送實驗相關PPT、課件、視頻材料及相關問題，要求學生根據具體情況選取材料、試劑，查閱相關文獻，撰寫實驗方案，并確定小組負責人及實驗工作分工。課堂講授階段學生以PPT形式匯報實驗流程及操作要點，各小組互評，對實驗方案不足之處進行修正，教師最后進行點評，確定實驗方案。隨后進入正式實施階段，考慮到實驗內容的連續性和百合生長的季節性，實驗操作安排在第10～11周教學工作日進行。第10周完成培養基的制作，第11周完成百合雜交果的取樣、消毒、無菌接種、培養工作。定期觀察百合雜交果的萌發狀態并統計數據，實驗全部結束后提交完整的實驗報告。

2.2.1 實驗材料的準備

1) 百合。以種植于宜春學院園藝基地的龍牙百合作母本，蘭州百合作父本，取授粉后生長45 d以上的雜交果作為實驗材料(圖1)。

圖1 百合雜交果

2) 儀器設備與試劑。儀器設備有超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、搖床、微波爐、移液器、離心機、光照培養箱、純水系統、磁力攪拌器等。試劑有MS培養基干粉、蔗糖、瓊脂粉、6-BA、NAA、HCL、NaOH、酒精燈。

2.2.2 實驗方法

1) 培養基的設計。根據筆者所在教學團隊前期探索結果，本次綜合實驗以1/2 MS為基本培養基，共設計9個組合培養基配方[6-7](表1)。

表1 不同激素配比的培養基配方

2) 外植體的消毒和接種。百合雜交果在流水下沖洗1 h，放入滅菌的空三角瓶中，置于超凈工作臺上，倒入75%酒精浸泡30 s，然后倒出，加入無菌水漂洗3次，取出雜交果放入另一滅菌的空三角瓶中，加入0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，期間不斷晃動，再用無菌水漂洗5次，清除殘留在材料表面的化學試劑，最后取出雜交果放在干燥的無菌濾紙上，吸干表面水分。用手術刀沿著果皮縫劃開，再用無菌鑷子取出有胚種子，在靠近酒精燈外焰處打開培養基瓶蓋，接種到培養基上。

3) 外植體的培養。胚萌發之前放在溫度25℃的暗室培養，2周后胚開始萌發移入光室培養，設定溫度25℃，光照強度2 000 lx，光照時間12 h/d。每組共9個處理(每個激素配比培養基配方對應一個處理)，每處理2瓶，每瓶接種2～3粒雜種胚，接種60 d后統計不同處理雜種胚萌發情況。

2.3 教學效果

本次綜合性實驗課程結束后，筆者與部分2017級學生進行了面對面交流，學生普遍對這類實驗的開設持滿意態度，主動提出要加入相關教師科研團隊從事簡單的研究工作；也有部分學生提出了自己的建議，即在培養基配方設計上是否可以按照多因素統計分析方法設計更多組配方，因為是首次嘗試，考慮到實驗材料比較緊缺，以免造成浪費，所以在下一年的實驗開設過程中將對此進行優化。

本實驗以宜春特色品種龍牙百合雜交果作為研究對象，利用植物組織培養中胚拯救技術克服大田雜交不親和導致百合雜交果不能發育成熟的問題，成功獲得雜種苗，為后期通過雜交培育優質百合種苗奠定了基礎。

通過以上綜合性實驗的開展，學生完全掌握了植物組織培養中胚拯救技術的知識要點，體會到了課本知識轉化為實踐成果的樂趣，激發學生學習興趣，促進了學生專業能力的培養。本綜合性實驗與實際生產結合緊密，注重培養學生對知識的應用能力，同時有利于激發學生的科研興趣。通過學習百合雜種胚拯救技術綜合實驗，把以前實驗教學中單一的項目全部串聯起來，對每一個知識點進行總結歸納，容易形成系統的知識架構，有利于創新思維能力的培養。

3 小結

龍牙百合胚拯救技術綜合性實驗選題來自百合團隊多年科研成果的部分內容，是科研學術成果轉化為教學內容的具體體現，實現了科研和教學的有機統一。學生在參與過程中，改變了過去被動學習知識的狀態，提高了創新創業和科研思維能力，也激發了其科研潛力[9]。總之，該實驗教學整合了植物組織培養實驗課中多個知識點，貼近實際，實驗效果好，有利于培養學生實踐能力與創新能力，能夠體現科研成果轉化為實驗教學的優越性，在后續教學過程中將逐步調整優化，爭取在更大學生群體和更多相近專業中進行推廣。