不同方法檢測(cè)女性生殖道病原微生物感染的臨床價(jià)值

劉長(zhǎng)愛(ài)

（天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院婦科，天津 300300）

女性生殖道病原微生物（pathogenic microorganism）感染是臨床婦科較常見(jiàn)的疾病類(lèi)型，具有復(fù)發(fā)率高、混合感染等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。研究表明[2，3]，解脲支原體（UU）、沙眼衣原體（CT）、生殖支原體（MG）是非淋菌性尿道炎（NGU）最常見(jiàn)的病原體，其中UU 的感染率為11%～26%，CT 為11%～50%，MG 為6%～50%。UU 是泌尿生殖道的常見(jiàn)微生物之一，據(jù)報(bào)道[4]，我國(guó)人群中UU 的感染率日趨上升，由于反復(fù)感染以及抗生素濫用等原因，使之成為發(fā)病率較高的性傳播疾病之一。UU 感染后，患者多無(wú)明顯癥狀，也易造成漏診。病原體分離培養(yǎng)法是其檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而分離培養(yǎng)操作復(fù)雜，所需時(shí)間較長(zhǎng)，且敏感度易受標(biāo)本采集方式等影響，因此對(duì)臨床常規(guī)檢測(cè)和流行病學(xué)篩查帶來(lái)一定的困難；加之培養(yǎng)法取樣采用拭子樣本，該取樣方式給病患帶來(lái)一定的痛苦，且結(jié)果判定具有一定的主觀(guān)性，易引起假陽(yáng)性和假陰性[5]。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（SAT）、培養(yǎng)法、乳膠法作為新一代的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于病原體檢測(cè)、血液病毒篩查、環(huán)境微生物檢測(cè)等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。基于此，本研究分別通過(guò)SAT、培養(yǎng)法、乳膠法對(duì)生殖道病原微生物感染女性進(jìn)行檢測(cè)，分析不同方法的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年12 月-2020 年12 月天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院收治的200 例疑似生殖道病原微生物感染女性作為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床癥狀均表現(xiàn)為分泌物增加、異味、外陰搔癢、灼痛、性交痛等，部分患者存在腰酸、小腹墜脹等癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并認(rèn)知障礙、嚴(yán)重臟器功能障礙、惡性腫瘤者。另選取200 名正常女性體檢者作為對(duì)照組。研究組年齡18～55 歲，平均年齡（40.14±6.58）歲；對(duì)照組年齡18～56 歲，平均年齡（40.46±6.14）歲。兩組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均自愿參與研究并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 固體培養(yǎng)法 將采集的樣本浸于液體培養(yǎng)基中，充洗脫分泌物后，再?gòu)囊后w培養(yǎng)基中吸取3 滴，每滴20 μl 的培養(yǎng)液，分別接種于固體A7 瓊脂平板的3 個(gè)不同位置上，待培養(yǎng)液滲透干后，翻轉(zhuǎn)A7 平板，接種面朝上，放置于35 ℃5%～10% CO2的孵箱中，經(jīng)48～72 h 觀(guān)察結(jié)果。

1.2.2 液體培養(yǎng)法 將采集的標(biāo)本插入培養(yǎng)液中，擠壓旋轉(zhuǎn)3 次，將培養(yǎng)液置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)48 h后觀(guān)察結(jié)果，若培養(yǎng)液變?yōu)榧t色并清亮透明即為陽(yáng)性，不變色即為陰性。若培養(yǎng)液變紅并伴有渾濁，則將培養(yǎng)液接種于10 mg/dl 血平皿中，按照臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定。

1.2.3 乳膠法 將采集的標(biāo)本插入生理鹽水中，擠壓旋轉(zhuǎn)3 次，即為待測(cè)樣本。測(cè)試時(shí)，將待測(cè)樣本滴入檢測(cè)卡加樣孔內(nèi)，陽(yáng)性標(biāo)本在測(cè)試區(qū)（T）內(nèi)會(huì)出現(xiàn)一條紅色條帶。陰性樣本由于不含檢測(cè)目的抗原，在測(cè)試區(qū)（T）內(nèi)不能形成夾心復(fù)合物，故沒(méi)有紅色條帶出現(xiàn)。

1.2.4 SAT 法 拭子標(biāo)本取出后放入1 ml 生理鹽水充分浸泡后貼壁擠干，取0.5 ml 與等體積的樣本保存液混合，即為待測(cè)樣本。使用MagX 全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先，病原體被裂解釋放出核酸，與核酸提取液中的相應(yīng)磁性顆粒特異度結(jié)合，利用磁珠吸附純化UU、CT、NG 和MG 的靶標(biāo)RNA。加入42 ℃預(yù)熱的SAT 酶液，于PCR 儀上擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針與RNA 拷貝特異性結(jié)合，產(chǎn)生的熒光由儀器進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判斷：dt 表示樣本曲線(xiàn)與閾值線(xiàn)交點(diǎn)的循環(huán)數(shù)，dt≤35 的標(biāo)本判為陽(yáng)性。

1.3 觀(guān)察指標(biāo) ①比較兩組UU、CT、淋病奈瑟菌（NG）和MG 的分布狀況；②比較液體培養(yǎng)法和SAT法檢測(cè)UU 陽(yáng)性率以及SAT 敏感度、特異度；③比較乳膠法和SAT 法檢測(cè)CT 陽(yáng)性率以及SAT 敏感度、特異度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過(guò)SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組生殖道病原微生物感染陽(yáng)性率比較 固體培養(yǎng)檢測(cè)顯示，研究組生殖道病原微生物陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組生殖道病原微生物感染陽(yáng)性率比較[n（%）]

2.2 液體培養(yǎng)法與SAT 法檢測(cè)UU 結(jié)果比較 SAT法檢測(cè)UU 陽(yáng)性59 例，陽(yáng)性率為47.20%；液體培養(yǎng)法檢測(cè)UU 陽(yáng)性50 例，陽(yáng)性率為40.00%；二者陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.318，P=0.251）。以液體培養(yǎng)法為參考標(biāo)準(zhǔn)，SAT 敏感度為94.00%，特異度為84.00%，見(jiàn)表2。

表2 液體培養(yǎng)法與SAT 檢測(cè)UU 結(jié)果比較（n）

2.3 乳膠法和SAT 檢測(cè)CT 結(jié)果比較 乳膠法檢測(cè)CT 陽(yáng)性1 例，陽(yáng)性率為3.70%；SAT 法檢測(cè)CT 陽(yáng)性2 例，陽(yáng)性率為7.41%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.353，P=0.552）。以乳膠法為參考標(biāo)準(zhǔn)，SAT 敏感度為100.00%，特異度為96.15%，見(jiàn)表3。

表3 SAT 檢測(cè)CT 敏感度與特異度（n）

3 討論

目前檢測(cè)女性生殖道病原微生物感染的方法以白帶常規(guī)檢測(cè)、生化檢測(cè)等為主，方法單一，且難以準(zhǔn)確反映出形態(tài)學(xué)、功能學(xué)等情況，臨床醫(yī)師無(wú)法對(duì)患者的陰道微生態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，極易發(fā)生誤診、漏診等現(xiàn)象[6]。因此，臨床中需要采用多樣化的檢測(cè)方式，對(duì)陰道分泌物進(jìn)行全面分析，使臨床醫(yī)師能夠充分了解生殖道微生態(tài)情況，明確致病因素，從而為臨床治療提供參考。

UU 是生殖道中較常見(jiàn)的共生微生物，其感染可能引發(fā)一系列疾病，如非淋菌性尿道炎、宮頸炎、慢性前列腺炎、附睪炎以及不孕不育等[7]。CT 屬于胞內(nèi)寄生的微生物，感染后可引發(fā)盆腔炎、宮頸炎、宮內(nèi)感染等多種疾病[8，9]。但研究發(fā)現(xiàn)[10，11]，約80%的CT 感染女性并未出現(xiàn)特異性臨床癥狀，往往會(huì)造成誤診、漏診，延誤最佳的治療時(shí)機(jī)，因此有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果對(duì)臨床診斷至關(guān)重要。NG 感染可能引發(fā)宮頸炎、尿道炎等疾病，且隨著疾病的發(fā)展，還可能導(dǎo)致盆腔炎、輸卵管炎等，甚至擴(kuò)散至全身，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，后果嚴(yán)重[12，13]。MG 不僅會(huì)增加尿道炎、宮頸炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并且近60%的子宮內(nèi)膜炎患者的宮頸黏液中能夠檢測(cè)出MG，說(shuō)明MG 感染與子宮內(nèi)膜炎和復(fù)發(fā)性盆腔炎密切相關(guān)。目前臨床中對(duì)于MG 的檢測(cè)僅能采用核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的方式，但該方法需要幾個(gè)月的培養(yǎng)時(shí)間，且敏感度有限[14，15]。本研究結(jié)果顯示，研究組生殖道病原微生物陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且UU 是女性生殖道檢出率最高的微生物，提示UU 和女性生殖道病原微生物感染存在著密切的關(guān)系。值得注意的是，本研究中CT 或MG 陽(yáng)性的患者中僅1 例為UU陰性，其余均為并發(fā)感染，提示不同病原體感染之間可能存在著一定的關(guān)聯(lián)性。

隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，病原體檢測(cè)方法需要滿(mǎn)足準(zhǔn)確、高效和靈敏等要求。RNA 檢測(cè)技術(shù)因其特異、靈敏的優(yōu)勢(shì)已廣泛用于生殖道病原體的檢測(cè)。RNA 檢測(cè)技術(shù)包括SAT 和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（TMA)，這兩種檢測(cè)方法的擴(kuò)增原理完全相同[16]。由于病原體細(xì)胞中的RNA 存在多個(gè)拷貝，故RNA 檢測(cè)技術(shù)相較于以DNA 有更高的準(zhǔn)確度，更重要的是只有活的病原體中存在完整RNA 片段，故能排除治愈后已死亡病原體對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[17]。RNA 具有易降解、不穩(wěn)定的特性，使得該法交叉污染可能性更小，可以有效減少假陽(yáng)性的產(chǎn)生，大大提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，有助于臨床診斷的準(zhǔn)確度和對(duì)療效的監(jiān)測(cè)。此外，RNA 檢測(cè)結(jié)果還可以用于臨床療效監(jiān)測(cè)，符合精準(zhǔn)醫(yī)療的要求，是目前生殖道病原體檢測(cè)的首選方法[14]。本研究中SAT 法和液體培養(yǎng)法檢測(cè)UU 結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但SAT法陽(yáng)性率更高，敏感度更強(qiáng)。SAT 法與乳膠法檢測(cè)CT 結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但前者陽(yáng)性率以及敏感度更高。基于SAT 法可以以尿液檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，兼具檢測(cè)時(shí)間短、假陽(yáng)性率低等優(yōu)勢(shì)，尤其當(dāng)受檢者正處于感染初期，病原體數(shù)量較少，DNA含量少，而RNA 較多，SAT 法對(duì)該類(lèi)患者的檢測(cè)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，故該技術(shù)更適合作為體檢檢測(cè)方法進(jìn)行人群篩選。然而由于SAT 法敏感度強(qiáng)，容易被環(huán)境中的病原體或異物污染，故對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件的要求更多，成本更高。此外，培養(yǎng)法可直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，有助于指導(dǎo)臨床用藥，該法更適合作為篩選后的確診方法。

綜上所述，女性生殖道病原微生物感染中以UU 最為常見(jiàn)，其次分別為CT、MG。目前臨床中常用的SAT 法、液體培養(yǎng)法、乳膠法在檢測(cè)方面均有一定的應(yīng)用價(jià)值，其中SAT 法對(duì)病原微生物感染的檢出率更高，可作為臨床首選的檢測(cè)方案之一。