NAMPT 在特發性肺纖維化血清和支氣管肺泡灌洗液中的表達及其意義

羅戈雯，何 杰，張 維

（成都醫學院臨床醫學院第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，四川 成都 610500）

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種以成纖維細胞增殖和細胞外基質沉積為病理特征的慢性肺部疾病，對于其發病機制目前沒有統一定論[1，2]。IPF 起病較為隱匿，呼吸困難或者肺泡炎是其早期主要表現，患者若出現了肺功能改變和影像學征象變化時，說明已經進展到疾病的中晚期，最終導致治療效果差，患者生存期短[3，4]。早期診斷和治療并加以動態評估，對于提高IPF 患者生活質量、延緩病程具有重要的意義[5]。研究報道顯示，炎癥和免疫效應細胞可以進入肺內并過度釋放肺內活性介質，促進細胞外基質沉積和肺成纖維細胞的增殖；同時肺部自噬水平的不足，肺泡上皮細胞產生上皮-間質效應，進一步加重了肺纖維化過程[6-9]。近年來，生物信息技術逐漸運用于呼吸系統疾病的靶基因篩選和機制的研究。因此，本研究通過生物信息分析技術篩選出GSE53845[10]、GSE24206[11]、GSE10667[12]三個IPF 基因芯片數據集中的自噬相關基因，通過檢測篩選出的自噬基因在IPF 患者支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和血清中的表達量，分析其與患者肺功能、呼吸困難評分以及肺泡灌洗液中巨噬細胞計數等指標的相關關系，探討自噬基因在特發性肺纖維化診斷及疾病評估方面的臨床價值，為臨床治療提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 數據來源 從GEO 數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載基因芯片數據集GSE24206、GSE10667 以及GSE53845。其中GSE24206 包含有IPF 肺組織標本17 個和正常肺組織標本6 個，GSE10667 包含有IPF 肺組織標本31 個和正常肺組織標本15 個，GSE53845 包含有IPF 肺組織標本40個和正常肺組織標本8 個。從人類自噬基因數據庫（HADb，http://www.autophagy.lu/）中獲取總的自噬相關基因數目222 個。

1.2 確定差異表達的自噬相關基因 使用R 軟件中的limma 包篩選（篩選條件為|logFC|＞2；adj.P.Value＜0.05）差異表達的基因，并與人類自噬基因數據庫中的自噬相關基因取交集。

1.3 研究對象 選取2018 年1 月-2020 年3 月于成都醫學院第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科就診的74 例IPF 患者作為IPF 組，30 例常規體檢的健康者作為對照組。IPF 組男性52 例，女性22 例，病程8個月～4 年，平均病程（12.42±0.44）月，年齡49～62歲，平均年齡（55.64±5.82）歲。納入標準：符合2018年的美國胸科學會（ATS）/歐洲呼吸學會（ERS）的IPF 診斷標準[13]：①除外已知原因引起的間質性肺疾病如藥物毒性作用、職業環境暴露、風濕免疫系統疾病等；②胸部HRCT 提示為普通間質性肺炎表現；③經纖支鏡活檢或支氣管肺泡灌洗檢查后排除其他疾病。排除標準：①合并其他嚴重肺部疾病；②合并嚴重心腦血管疾病；③合并風濕免疫性疾病或惡性腫瘤、職業暴露等引起的肺間質纖維化；④具有明確病因所導致的呼吸困難和肺功能檢查結果的異常。對照組男15 例，女15 例，年齡50～58 歲，平均年齡（54.52±2.83）歲。對照組既往無呼吸系統相關的慢性疾病，近期肺功能及胸部CT 均無明顯異常，也無呼吸道感染癥狀。本研究通過成都醫學院第一附屬醫院倫理委員會討論同意，倫理號20180124B，所有研究對象均充分了解實驗目的及作用，并分別簽署知情同意書。

1.4 方法 支氣管肺泡灌洗與血清采樣：患者經常規局部麻醉后行纖支鏡檢查，選擇左肺舌葉或右肺中葉進行支氣管肺泡灌洗，在選定的肺葉開口處注入100 ml 溫度為35 ℃的生理鹽水，將BALF 回收至收集瓶中，回收率＞35%，收集BALF 后立即進行靜脈采血5 ml。BALF 經無菌紗布過濾以后注入離心管中，在4 ℃環境以1200 r/min 的速度離心10 min，取上清液注入無菌透析袋10 倍濃縮，再浸入到50%聚乙二醇溶液中10 倍濃縮，24 h 后加入生理鹽水，取濃縮液置于-80 ℃冰箱保存以備用。檢測時提取原液體積的10%復溶，沉淀物經細胞學檢測，檢測的試驗方法參考《中華醫學會呼吸分會支氣管肺泡灌洗液細胞學檢測技術規范（草案）》[14]。靜脈采樣血液經離心后，取上清液于-80 ℃冰箱保存備用，將所有患者的血清和灌洗液收集齊后一次性檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 BALF 和血清中的NAMPT 水平檢測 采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測兩組研究對象血清和BALF 中NAMPT 水平，試劑盒由上海酶聯生物科技有限公司（編號：TMl060212）提供。用標準曲線計算NAMPT 的濃度（ng/ml）。

1.5.2 肺功能檢查 記錄用力肺活量（FVC）、一氧化碳彌散量占預計值百分比（DLCO%）、第一秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%）。

1.5.3 呼吸困難評分測定 納入的IPF 患者均參照改良英國醫學研究委員會呼吸困難量表評分（mMRC）[15，16]評估呼吸困難程度，見表1。

表1 呼吸困難評分（分）

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0 軟件對所有數據進行統計學分析，計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗；線性相關性分析采用Pearson 法，以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息分析結果 GSE53845 篩選出差異基因92 個、GSE24206 篩選出差異基因51 個、GSE10667篩選出差異基因134 個，見圖1，三個數據集與自噬相關基因取交集篩選出1 個自噬相關基因NAMPT，見圖2。

圖1 三個數據集的熱圖

圖2 自噬相關基因的韋恩圖

2.2 兩組BALF 和血清中NAMPT 水平比較 IPF 組患者BALF 中及血清中的NAMPT 水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組BALF 和血清中的NAMPT 水平比較（，ng/ml）

表2 兩組BALF 和血清中的NAMPT 水平比較（，ng/ml）

2.3 兩組細胞學總數及分類計數比較 IPF 組BALF中巨噬細胞百分數高于對照組，淋巴細胞百分數低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組細胞學總數及分類計數比較（）

表3 兩組細胞學總數及分類計數比較（）

2.4 IPF 組BALF 和血清中NAMPT 水平與肺功能指標的相關性 IPF 組患者BALF 中NAMPT 水平與FEV1%、FVC 和DLCO%呈負相關（r=-0.687，-0.701，-0.622，P＜0.05）；血清中NAMPT 水平與DLCO%呈負相關（r=-0.414，P＜0.05）；IPF 組患者mMRC 評分為（2.90±1.32）分，患者BALF 和血清中的NAMPT 水平與mMRC 呈正相關（r=0.544，0.532，P＜0.05），見表4。

表4 IPF 組BALF 和血清中NAMPT 水平與肺功能指標的相關性

3 討論

IPF 是間質性肺炎中的一種常見類型，起病隱匿且發病機制不清，主要臨床癥狀缺乏特異性，表現為咳嗽、咳痰、呼吸困難，較容易與COPD、支氣管擴張癥、塵肺等其他呼吸系統慢性疾病相混淆[17]。然而，IPF 一旦出現了典型的影像學改變或者肺功能檢查提示有限制性通氣功能障礙，說明疾病已經進展到了中晚期[18]。由于缺乏有效的IPF 藥物治療，大多數患者確診后的中位生存期僅為2.5～4 年，預后極差[19]。目前臨床上通常采用臨床表現、影像學評估以及肺功能檢測等方法對IPF 進行疾病診斷和預后評估，但是上述方法的敏感性和特異性均不高，而且評價項目過于繁多復雜，在診斷的過程中很容易受到臨床醫生存在的主觀因素的干擾，最終降低了對于IPF 診斷的準確性[20]。肺組織病理活檢雖然是診斷IPF 病情進展的金標準，但獲取肺組織的方式通常采用開胸肺活檢或者冷凍肺活檢，這種有創性操作技術難度大，風險高，在基層醫院難以廣泛開展。因此，積極尋求一種簡便的IPF 相關血清生物標志物顯得十分重要。

IPF 預防和治療的理論基礎來自該病的發病機制，國內外許多研究從信號轉導機制、氧化應激、細胞自噬、炎癥因子等多個方面探究了IPF 的發病機制，雖然未完全揭露IPF 的病因，但是深刻了對IPF疾病的認識，尤其在細胞自噬領域開展了一系列對于IPF 機制的研究[21]。Sosulski ML 等[22]通過構建肺纖維化模型發現，模型中泛素化蛋白水平和多功能蛋白p62 水平高于對照組；通過直觀的細胞電鏡對肺纖維化模型進行觀測發現模型中自噬體數量明顯減少，這些現象均提示了肺纖維化過程中肺內伴有明顯的自噬不足。細胞自噬在一個適度的水平可以保持肺組織細胞活性和維持內環境的穩定，然而在肺纖維化形成的過程中細胞的應激反應導致了細胞自噬功能的失調。Romero Y 等[23]研究指出，IPF 中的肺成纖維細胞顯示出持續的mTOR 通路激活，而該通路對自噬有抑制作用，激活的mTOR 信號通路導致自噬水平明顯不足，促進了肌成纖維細胞的分化，最終導致肺纖維化的形成。本研究通過生物信息分析技術篩查IPF 相關的自噬基因發現，在GSE53845、GSE24206、GSE10667 三個IPF 相關數據集中，自噬基因NAMPT 都存在著過表達，NAMPT同時也是哺乳動物細胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補救合成通路的限速酶，參與了調節細胞內重要的病理生理過程，在細胞自噬過程中，NAMPT 可以合成NAD，激活去乙酰化酶SIRT1 和PARP，從而抑制細胞自噬，促進成纖維細胞增殖；被釋放到細胞外的NAMPT 還與其他炎癥因子存在一定的交互作用，一方面炎癥因子如白介素-1、TNF-α、TGF-β 能刺激NAMPT 釋放，另一方面NAMPT 也能顯著上調白介素-1、TNF-α、TGF-β 等細胞因子的表達[24，25]。因此，NAMPT 所具有的調節免疫和抑制細胞自噬的功能在IPF 的機制中可能發揮著重要作用。

為了進一步驗證生物信息分析結果，本研究比較了IPF 患者和健康對照者的BALF 和血清中NAMPT 水平、BALF 中的細胞計數及肺功能結果，發現兩組檢測結果的差異具有統計學意義（P＜0.05）；將IPF 患者血清及BALF 中的NAMPT 水平與肺功能和mMRC 評分進行相關性分析，發現IPF組患者BALF 中NAMPT 水平與FEV1%、FVC 呈負相關；血清中NAMPT 水平中的NAMPT 與DLCO%也呈負相關，IPF 組患者BALF 和血清中的NAMPT水平與mMRC 呈正相關，提示肺功能越差的IPF 患者其血清和肺泡灌洗液中的NAMPT 水平越高，分析其原因可能與NAMPT 過表達導致肺泡上皮細胞自噬功能下降，肺成纖維細胞過度增殖有關。由此可見，血清和BALF 中NAMPT 水平可作為評估IPF病情嚴重程度的一個可靠指標。而血清和BALF 的測定具有簡便性和可重復性，可用于臨床監測IPF患者病情變化。本研究也有一定局限性，由于納入研究的病例數較少，隨訪時間太短，未對患者的生存預后與NAMPT 的關系進行更深入的探索，因此在今后的研究中，本課題組將擴大樣本量和延長隨訪時間，以期對本研究結果進行更進一步的確認。

綜上所述，IPF 患者BALF 和血清中NAMPT 水平明顯升高，且與患者肺功能和呼吸困難評分顯著相關，有助于對IPF 患者的病情狀況進行長期動態評估。