油菜素內酯對低溫脅迫下番茄幼苗生理指標的影響

王光正，呂劍，毛娟，陳佰鴻，馮致，馬宗桓

(甘肅農業大學園藝學院，甘肅 蘭州 730070)

番茄(SolanumlycopersicumL.)原產于南美洲西部的秘魯、智利、玻利維亞及厄瓜多爾等國家的高原或谷地,是茄科(Solanaceae)番茄屬(LycopersiconMiller)中以成熟多汁漿果為食用器官的草本植物[1].番茄是維生素的重要來源，也是小農和中等規模商業農民大量種植的經濟作物.許多研究表明，番茄在農藝條件允許的任何地方都是以商業化的數量種植的[2]，但在中國北方露地和設施早春栽培中，易受到低溫冷害，造成番茄生產受到嚴重影響.冷害會造成植株苗弱、生長遲緩、萎蔫、黃化、局部壞死、坐果率低、產量降低和品質下降等不良影響[3].而在番茄幼苗期，低溫脅迫對植株影響尤為嚴重，番茄屬于冷敏感性強的作物，溫度低于10 ℃時生長發育受阻，氣溫為8 ℃時，生長量增加遲緩，5 ℃時生長完全停止，生產上常因低溫的影響而使其生育期受阻[4].即使短期低溫，植株生長也會受到抑制.近些年在日光溫室的發展過程中，由于冬春季氣候變化和設施覆蓋材料保溫性、透光性能的局限性，易引起溫室內低溫弱光等不良環境條件，限制了設施番茄的生產，使得冬春茬番茄的冷害問題變得日益突出.眾多研究表明，低溫脅迫導致番茄生理代謝受到顯著抑制，如光合作用降低、抗氧化酶活性下降、葉綠素降解、生長發育受阻等.因而，研究提高設施番茄在低溫脅迫下的適應性顯得尤為重要[5-6].

前人研究中，發現許多類型的激素可以提高番茄的低溫適應性，例如褪黑素預處理可以通過降低番茄葉片氧化脅迫提高光合碳同化能力、提高番茄葉片的抗氧化能力、增加蔗糖、脯氨酸和多胺的積累來顯著緩解番茄低溫脅迫[7].油菜素內酯(BR)是一種新型植物激素，在植物體內含量極低，但生理活性卻極高，植物經極低濃度BR處理后便能表現出明顯的生理效應[8-10]，BR和褪黑素效果類似，能減輕不同抗冷性的植物幼苗在低溫脅迫中的傷害作用，研究發現BR對低溫脅迫下番茄幼苗的光合機制有積極的影響[11]，而且BR能促進幼苗根系和基葉的正常生長和健壯度，其作用方式是通過阻止植物幼苗產生過多的自由基或誘導形成較多的自由基清除劑，例如抗氧化酶可以減輕膜脂過氧化作用，從而穩定膜的結構與功能，增強膜的防衛能力，以適應低溫逆境的變化[12-13].但BR是否對番茄在低溫脅迫下生長有緩解的研究并不多見，本研究通過測定BR處理的番茄幼苗在不同時段低溫逆境下的生理指標，來探究BR在番茄幼苗應對低溫脅迫中的作用，旨在為番茄抗逆育種和品質改良提供理論基礎和技術支持，同時也能對BR在番茄生產中的應用具有一定的指導意義.

脫落酸(Abscisic acid,ABA)是一種以異戊二烯為基本單位的倍半萜羧酸，早在上世紀六十年代就被科學家發現，被認為是五大類植物激素之一[14]，具有促進脫落、促進休眠、抑制生長、提高抗逆性的作用.但是不同濃度的脫落酸對園藝作物有不同的影響，如在茄子幼苗的低溫脅迫中，10 mmol/L的ABA可以有效緩解茄子幼苗的低溫脅迫，而40 mmol/L的ABA緩解效果不明顯[15]，另外在低溫脅迫對豇豆幼苗生理生態影響的研究中也同樣發現低濃度(10 mmol/L)的ABA緩解效果最好，高濃度(40 mmol/L)的ABA緩解效果不顯著[16].而BR作為抗逆境脅迫植物激素的新秀，可以通過與ABA互作參與調控植物的多種抗逆過程，但不同逆境所涉及的分子調控機制不同，因此BR和ABA的關系既有拮抗，又有協同，取決于所響應的逆境種類.例如鹽脅迫條件下，BR拮抗ABA的耐鹽效應；而在干旱和氧化脅迫條件下，BR與ABA共同提高植物的抗性等[17].但是ABA是否會對BR的抗低溫效果有抑制作用的研究也不多見.本試驗對低溫脅迫下的番茄幼苗分別噴施BR及其抑制劑ABA，以明確BR在不同時段緩解低溫脅迫的生理基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為番茄，品種為卡焰.番茄種子在60 ℃溫水浸種后用紗布包裹置于培養皿中，將培養皿轉移至氣候箱中進行催芽，溫度設置為恒溫25 ℃，光照為0.發芽后在玻璃溫室中定植，基質為草炭∶珍珠巖∶蛭石∶甘肅農業大學園藝學院自制營養基質= 9∶3∶3∶1，每盆一株.育苗至兩片真葉期，期間每天澆水、每隔4 d噴施一次1 000倍的吡蟲啉以防白粉虱，兩片真葉后移植到10 cm×10 cm小花盆中.

1.2 試驗設計

在番茄四葉期，挑選長勢一致的番茄植株(株高在15 cm左右)隨機分成3組，每組為一個處理，每個處理45株，每15株為一個重復.然后將3個處理組植株都轉移至氣候箱中，條件設置為光周期為16 h光照、8 h黑暗，溫度為光照時10 ℃，黑暗條件下4 ℃，光照強度為4 000 lx，相對濕度為60%.3個處理分別為T1：噴灑去離子水；T2：噴灑0.5 μmol/L油菜素內酯溶液；T3：噴灑0.5 μmol/L油菜素內酯溶液和50 mmol/L脫落酸溶液；對照為T1.所有處理于每天上午9∶00噴灑一次相應溶液，連續處理3 d，每次噴至葉面有水滴滴落為止.在開始處理后的0、24、48、72 h取樣測定丙二醛含量、電導率、光合指標、抗氧化酶活性、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性.

1.3 測定方法

1.3.1 光合生理指標的測定 利用LI-6400便攜式光合測定分析儀于晴天早上9∶00～11∶00測定光合生理學參數，測定時用開放式氣路，大氣CO2濃度基本在340～380 μmol/mol，控制溫度25 ℃,相對濕度60%，PAR控制在1 000 μmol/(m·s)，測定葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci).

1.3.2 生理指標的測定 電解質滲透率和MDA含量測定參照文獻[7]并稍作修改，SOD酶活性測定用氮藍四唑法[18]，POD酶活性測定采用愈創木酚法[19]，CAT酶活性測定采用分光光度法[20].SS酶、SPS酶均采用(分光光度法)試劑盒進行測定(蘇州科銘生物有限公司).

1.4 數據統計與分析

數據采用Excel 2010軟件進行處理和圖表繪制，后用SPSS軟件進行Duncan多重比較分析.

2 結果與分析

2.1 油菜素內酯對番茄MDA和電解質滲透率的影響

油菜素內酯顯著抑制了番茄幼苗體內的MDA含量，如圖1-A所示，脅迫72 h后，T2處理番茄的MDA含量僅為6.406 μmol/g而T1處理番茄的MDA含量是T2的3倍，達到19.261 μmol/g.T3處理番茄的MDA含量是T2的1.6倍，為10.50 μmol/g，T2處理番茄的MDA含量顯著低于T1和T3.

T1：低溫；T2：低溫+BR；T3：低溫+BR+ABA.T1：Cold；T2：Cold+BR；T3：Cold+BR+ABA.圖1 油菜素內酯及脫落酸對番茄葉片MDA含量以及電解質滲透率的影響Figure 1 Chilling effect on malonaldehyde (MDA) content (A) and electrolyte leakage (B) in leaves of seedlings of tomato in different periods by BR and ABA

圖1-B顯示低溫脅迫下電解質滲透率隨著脅迫時間的增加而增加，但油菜素內酯顯著抑制了番茄幼苗體內電導率的上升.脅迫72 h后，T2處理番茄的電導率為63%，而T1處理番茄的電解質滲透率為93%，是T2的1.5倍.T3處理番茄的電解質滲透率為80.6%，是T2的1.3倍，均顯著高于T2.

2.2 油菜素內酯對番茄光合系統的影響

油菜素內酯顯著緩解了低溫脅迫后番茄幼苗體內Ci值的上升，脅迫72 h后，T1處理番茄的Ci是T2的1.3倍，T3是T2的1.2倍，T2處理番茄的Ci僅為564 μmol/mol，顯著小于T1和T3(圖2-A).

由圖2-B可以看出，脅迫24 h后，T2處理番茄的Pn為9.1 μmmol/(m·s)，是T1的4倍，是T3的1倍，差異顯著，并且在脅迫的72 h中，T2處理番茄的下降速度明顯慢于T1，說明BR可以對保護番茄幼苗在低溫脅迫下的光合速率有一定作用.

對于氣孔導度，脅迫24 h后T2處理番茄的Gs為222 mmol/(m·s)，是T1、T3的1.3倍和1.2倍，脅迫48 h后T2的Gs下降到170 mmol/(m·s)，但仍然高于T1、T3，分別是T1、T3的1.5和1.3倍(圖2-C).

T1：低溫； T2：低溫+BR； T3：低溫+BR+ABA.T1：Cold； T2：Cold+BR； T3：Cold+BR+ABA.圖2 油菜素內酯及脫落酸對番茄葉片光合系統的影響Figure 2 Photosynthetic traits as affected by BR and inhibitor in tomato leaves under cold stress

2.3 油菜素內酯對番茄抗氧化酶活性的影響

24 h低溫脅迫后T2處理番茄的CAT活性為4.67 U/g，是T1、T3的1.6倍，脅迫48 h后達到6.93 U/g，是T1、T3的1.5倍.脅迫72 h后T2比T1和T3高了2.5倍、2.0倍(圖3-A)，達到12.68 U/g.3個時段T2處理番茄的CAT活性均顯著高于T1和T3.

T2處理番茄的POD活性在低溫脅迫48 h后達到19.52 U/g，是T1的1.5倍，是T3的1.3倍.在低溫脅迫72 h后升高到21.82 U/g，是T1的1.5倍，是T3的1.3倍，兩個時段下T2處理番茄的POD活性均顯著高于T1、T3(圖3-B)

低溫脅迫72 h后，T2處理番茄的SOD 活性為21.41 U/g，T1為11.71 U/g，T3為12.57 U/g，此時T2是T1的1.8倍，是T3的1.7倍，SOD活性均顯著高于T1和T3(圖3-C).

2.4 油菜素內酯對番茄植株內蔗糖代謝相關酶的影響

從圖4-A中可以看到，在3個處理中T1、T3兩組番茄的SPS增長處理番茄極其微小，脅迫48 h后兩組分別增長了59.02 μg/(min·g)、40.67 μg/(min·g)，但是T2處理番茄的SPS增長顯著，48 h后增加了244.75 μg/(min·g).在低溫脅迫48 h時，T2處理番茄的SPS活性是T1、T3的SPS活性的1.6倍,即使在72 h時T2的SPS活性有所下降，也比其他兩個處理組高1.5倍，差異仍然顯著.

T1：低溫；T2：低溫+BR； T3：低溫+BR+ABA.T1：Cold；T2：Cold+BR；T3：Cold+BR+ABA.圖3 油菜素內酯及抑制劑對番茄幼苗抗氧化酶活性的影響Figure 3 Changes in activities of antioxidant enzymes as affected by BR and inhibitor in tomato leaves under cold stress

低溫脅迫48 h時，T2處理番茄的SS為521.12 μg/(min·g)，是T1的1.5倍，是T3的1.3倍，在低溫脅迫72 h時T2處理番茄的SS為493.39 μg/(min·g)，比其余兩個處理高1.4倍(圖4-B)，均達到顯著差異.

T1：低溫；T2：低溫+BR；T3：低溫+BR+ABA.T1：Cold；T2：Cold+BR；T3：Cold+BR+ABA.圖4 低溫脅迫下油菜素內酯及抑脫落酸對番茄幼苗蔗糖代謝相關酶活性的影響Figure 4 Changes in activities of sucrose metabolism-related enzymes as affected by BR and inhibitor in tomato leaves under cold stress

3 討論與結論

低溫脅迫下植物體內首先受到損害的是細胞膜系統.而MDA 含量和電解質滲透率是用于表示細胞膜受損害程度的兩個重要指標，有研究發現，外源BR能有效地緩解低溫脅迫對華山松幼苗的影響，降低活性氧對其幼苗的傷害，減輕膜脂過氧化程度，提高華山松幼苗的抗寒能力，還有研究發現BR可以有效抑制低溫脅迫下竹筍的MDA和電解質的泄露[21-22].本試驗中，低溫脅迫處理的番茄幼苗葉片中的 MDA含量和電導率迅速增加，但BR處理的番茄幼苗MDA含量和電導率在72 h時顯著優于低溫脅迫處理的幼苗，表明細胞膜系統在低溫脅迫下會受到嚴重的氧化損傷，而BR處理則有效緩解了細胞膜的損傷從而保護番茄幼苗體內膜系統.

在羊草和油桐的低溫脅迫研究中也發現BR能夠減小低溫脅迫對細胞膜的毒害作用同時降低電解質滲透率，從而提高這兩種植物的抗寒性，同時發現MDA 含量和電解質滲透率的降低可能是由于番茄幼苗葉片中的抗氧化物酶活性增高引起的[23-24].許多研究表明BR的確能夠提高一些植物在脅迫環境下體內抗氧化酶的活性[25-26]，比如在辣椒幼苗的抗低溫脅迫研究中發現低溫對辣椒幼苗體內的抗氧化酶有顯著影響，而外源EBR處理可調節辣椒根系形態和提高根系抗氧化酶活性，增強植株抗低溫脅迫的能力[27-28].在野生垂穗披堿草幼苗的抗低溫研究中發現，施用BR后抗氧化酶基因的表達量均得到上調，說明了BR對低溫具有有效的緩解作用[29].本試驗中經BR處理的低溫脅迫環境下的番茄幼苗在72 h時SOD、CAT、POD的活性都比不施用BR的番茄幼苗高(圖3)，這說明BR處理對于提高番茄幼苗在逆境脅迫下的抗氧化能力以保護膜系統從而維持番茄幼苗生理代謝系統的正常運轉具有明顯效果.

在BR對低溫脅迫下黃瓜幼苗光和系統影響的研究中發現，BR可以有效緩解黃瓜在低溫脅迫下的光合作用[30]，而在上述羊草和油桐的研究中也證實了BR對植物光合系統的緩解作用和可溶性糖生成的促進作用.而本試驗中，BR處理的番茄幼苗Pn、Ci、Gs三項生理指標均顯著優于對照，說明BR處理也可以緩解因低溫脅迫對番茄幼苗光合系統運轉的不利影響，保證光合作用的正常進行.番茄幼苗經48 h的脅迫后，BR處理的番茄幼苗SPS活性和SS活性是對照的1.67倍，說明了BR對低溫脅迫下番茄幼苗體內蔗糖的生成有一定促進作用，在一定程度上可以幫助番茄幼苗維持體內的可溶性糖含量以維持滲透平衡從而保護幼苗的生理代謝.

脫落酸(ABA)是一種植物生長調節劑，它能促進葉片衰老，加快植株代謝.擬南芥基因芯片結果顯示BR和ABA協同調控超過200個共同的目標基因，還有研究發現BR處理擬南芥和油菜種子可提高植株對干旱和低溫脅迫的耐受性，該過程涉及對ABA合成及多個脅迫相關基因(RD29A、ERD10和RD22)表達的誘導[17].在本試驗中，BR和ABA同時處理的番茄幼苗在脅迫72 h后其電導率是經BR處理幼苗的1.28倍、MDA含量是BR處理的1.64倍、Pn是BR處理的2.26倍；在抗氧化物酶活性上，只經BR處理的幼苗比BR、ABA共處理的幼苗高1倍以上；脅迫48 h后，只經BR處理的幼苗的SPS活性和SS活性是BR、ABA共處理的1.3倍.這些數據表明若在番茄幼苗的抗低溫脅迫中ABA和BR同時施用，那么ABA會對BR的低溫緩解效果產生抑制作用.

綜上所述，BR處理的番茄幼苗在低溫逆境下的各項生理指標均優于對照，并在72 h時保護番茄幼苗膜系統完整性的效果最顯著，在48 h時對番茄幼苗體內蔗糖轉化的促進效果最顯著，表明BR在保護膜系統、提高幼苗抗氧化能力、保護光合系統、維持滲透平衡方面有著十分顯著的效果.意味著BR對于低溫逆境下番茄幼苗的生長有一定的促進和保護作用，可以提高番茄幼苗對低溫脅迫下的抗性.而ABA對BR具有抑制作用，二者同時施用不會提高番茄幼苗的抗冷性.