渝產葉用銀杏種苗質量的分級標準

徐進，譚均，楊美森，張應

(1.重慶市中藥研究院，重慶市中藥良種選育與評價工程技術中心，重慶 400065；2.秀山縣中藥材產業中心，重慶 秀山 409900)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(Ginkgobiloba)秋季葉尚綠時采收的干燥葉[1]，含有廣泛的具藥理活性化學成分，尤其是黃酮類和萜類化合物[2-3].銀杏葉提取物具有擴張血管、改善腦循環、抑制血小板活化因子的作用[4]，是當今世界最熱門的植物藥產品之一[5].為了適應工業生產對銀杏葉質量的要求，國內從1992年開始發展用于收獲綠葉的葉用銀杏種植基地[6]，針對與果用、林用銀杏生產特性的差異，開展了葉用銀杏良種選育、密度控制、營養調控等種植技術的研究[6-7].

種子種苗是中藥材生產的物質基礎[8]，優質種苗是提高藥材產量、質量和用藥安全性的根本保障[9].我國中藥材主要栽培品種有300多種，目前中藥材種子種苗地方標準只頒布130多項，涉及91個中藥材品種，人參、甘草等5項國家標準，人參、三七兩項國際標準[9-10]，中藥材種子種苗質量分級標準研究及標準制訂仍需加快進程.近年來，重慶地區開始大量發展葉用銀杏種植基地，但種源混亂，種質混雜，種苗質量參差不齊，且無葉用銀杏種苗質量分級標準可供借鑒[11-13]，嚴重制約葉用銀杏規范化生產.本文收集重慶地區葉用銀杏實生苗，結合生產實際開展種苗質量分級標準研究，旨在為葉用銀杏種苗標準的制訂提供科學依據，規范種植源頭，保障葉用銀杏種苗生產及流通，促進重慶地區葉用銀杏的規范化發展.

1 儀器與材料

1.1 試驗材料

2018年12月在重慶葉用銀杏主產區云陽、秀山、彭水、萬州等縣/區共收集30個批次葉用銀杏種苗，樣品編號和具體產地見表1.所有種苗均為采自育苗基地樹齡2 a的實生苗，每批樣品隨機選取100株，經重慶市中藥研究院瞿顯友研究員鑒定為植物銀杏(Ginkgobiloba).

表1 30批葉用銀杏種苗來源

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 Angilent 1260高效液相色譜儀及Chem Station工作站(美國安捷倫公司)；Alltech 2000 ES蒸發光散射檢測器(美國奧泰公司)，QUINTIX125D-1CN十萬分之一天平(德國賽多利斯公司)，Mill-Q advantage A10超純水儀(法國默克密理博公司).

1.2.2 試劑 銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、白果內酯、槲皮素、山奈酚、異鼠李素對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為190515 02、19090505、19092601、19101701、19101104、18101911和19080310)；純度≥99%(HPLC).液相用甲醇、乙腈均為色譜純；其余試劑均為分析純.

2 方法

2.1 種苗質量指標的測定

測定每株種苗的株高、地徑、主根長、一級側根數、分枝數，統計每批次種苗分枝率.株高測定采用精度為1 mm直尺測量種苗地上部分長度；地徑測定采用游標卡尺測量地上部分離地2 cm處非膨大處直徑；主根長測定采用精度為1 mm直尺測量種苗主根長度；一級側根數為主根上超過2 cm的側根數量；分枝數為主干上長于2 cm的分枝數量；分枝率為同批次中具有分枝的種苗占種苗總數百分比.

2.2 種苗質量分級標準的制訂

采用SPSS 19.0統計軟件對葉用銀杏種苗質量指標進行統計描述、相關性分析和聚類分析，根據分析結果和生產實際按照最低定級原則制訂銀杏種苗質量分級標準，即同一等級種苗的任一指標若達不到標準則降為下一級.

2.3 種苗質量分級標準驗證試驗

2018年12月底，選取同一來源1級、2級、3級和不合格葉用銀杏種苗，采用隨機區組設計，3次重復，共12個區組，每個小區100 株，按株行距0.5 m×0.6 m，定植于重慶市博責農業公司基地.

2019年8月底葉片尚綠時，選擇連續多日晴天后采收，采收前統計各小區成活率，每小區隨機選取10株測定生長指標和單株葉鮮重.成活率為每小區內成活植株占定植總株數的比率；新發主莖長測定采用精度為1 mm直尺測量本年度新生主莖長度；總分枝數為末端枝條超過2 cm的枝條總數；新發枝條數為當年從主干或枝條上萌發出超過2 cm枝條數量；葉片數為所有正常伸展葉片總數.將各小區銀杏葉稱重后，帶回實驗室50 ℃烘干至恒重，計算折干率，粉碎過60目篩后用于質量測定.

2.4 藥材質量評價

銀杏葉含量按《中國藥典》(2020版一部)方法進行測定[1].

3 結果與分析

3.1 種苗質量的測定

對30批葉用銀杏種苗株高、地徑、主根長等6個質量指標的測定結果見表2，各質量指標的統計分析結果見表3.不同產地種苗的株高、地徑、根長、一級側根數、分枝數等指標差異均達到極顯著水平(P<0.01)，均可作為葉用銀杏種苗質量分級標準的依據.各質量指標變異幅度分別為株高13.00～135.00 cm、地徑3.09～18.53 mm、主根長1.00～50.00 cm，一級側根數1～50根，分枝數0～14枝，分枝率3%～78%.變異程度為分枝率>分枝數>一級側根數>主根長>株高>地徑.

表2 30批葉用銀杏種苗質量測定

表3 葉用銀杏種苗質量指標統計分析 (n=3 000)

3.2 種苗質量分級指標的確定

葉用銀杏種苗質量指標的相關分析見表4.葉用銀杏種苗株高與地徑、平均分枝數、分枝率極顯著正相關(P<0.01)；主根長與一級側根數存在極顯著正相關(P<0.01)；主根長與株高、分枝率顯著正相關(P<0.05).說明葉用銀杏種苗地上、地下部分的質量指標分別具有極顯著相關性，地上和地下部分的生長又具有關聯性.

30批銀杏種苗質量指標的主成分分析結果見表5.主成分因子1、因子2特征值均大于1，累計貢獻率達81.01%，具有較強的信息代表性，可以概括種苗質量.決定因子1大小的主要指標為株高、地徑和分枝率性狀分量，決定因子2大小的主要指標為根長、一級側根數和平均分枝數性狀分量.理論上株高等6個指標均可作為銀杏苗的分級參考指標.

表4 葉用銀杏種苗質量指標的相關分析

表5 各質量指標的特征向量及貢獻率

根據葉用銀杏種苗株高等6項質量指標進行K-均值聚類，結合生產實際擬分為3個等級，得到3個等級種苗質量標準的最終聚類中心值，見表6；分級指標的方差分析結果見表7.F值從大到小依次為分枝率>株高>地徑>主根長>平均分枝數>一級側根數，不同批次銀杏種苗間株高、地徑、分枝率差異顯著.

表6 葉用銀杏種苗質量指標K-均值聚類的最終類中心值

表7 葉用銀杏種苗質量指標的方差分析

因此，6個質量指標均能反映種苗質量；株高、地徑、分枝率對分級影響顯著，應作為分級指標；一級側根數、平均分枝率對分級影響不顯著，不同等級最終聚類中心值差異不大，可作為約束性指標；因種苗移栽時須剪去過長主根，以促進側根和一級側根生長，生產上考察主根長意義不大，不建議作為分級指標.

3.3 種苗質量分級標準的制定

聚類分析各類間中心距離結果見表8.第2類和第3類間中心距離最大，其次為第1類和第2類，第1類和第3類中心距離最小.說明30個不同來源銀杏種苗可劃分為3個質量等級，第2類屬于一級苗，第1類屬于二級苗，第3類屬于三級苗.

表8 各指標最終聚類各類間中心距離

以聚類中心值為參考，結合生產實際制定銀杏種苗等級標準，見表9.根據分級標準，30批銀杏種苗觀測樣本中一級種苗2批，二級種苗7批，三級種苗13批，不合格苗8批，分別占征集種苗批的6.67%、23.33%、43.3%和26.67%.

3.4 種苗質量分級標準驗證

3.4.1 不同等級種苗生長情況 不同等級葉用銀杏種苗定植次年存活率和生長情況見表10.由表10可知，不同等級銀杏苗定植次年成活率、總分枝數、新發枝條數、葉片數、新發主莖長、單株鮮葉質量具有一定差異，且差異顯著(P<0.05).其中一級苗總分枝數、葉片數、新發主莖長、單株葉片鮮重極顯著高于其他等級.一、二級苗總分枝數、新發枝條數、葉片數極顯著高于三級苗和不合格苗，三級苗和不合格苗各生長指標差異不顯著.

3.4.2 不同等級種苗產量 不同等級葉用銀杏種苗定植次年產量情況見表11.不同等級種苗定植次年的單株鮮葉質量和折算畝產量均存在顯著差異，種苗等級越高產量越高.一級苗單株鮮葉質量和折算畝產量最高，分別達59.0 g和46.53 kg/667 m2，該級單株鮮葉質量顯著高于其他等級種苗，二級、三級和不合格苗間無顯著差異；二級苗折算畝產量與三級苗的無顯著差異，顯著高于不合格苗的.不同等級種苗種植次年產葉的折干率無顯著差異.

表9 葉用銀杏種苗質量分級標準

表10 不同等級葉用銀杏苗次年生長情況

3.4.3 不同等級種苗藥材質量 對不同等級葉用銀杏種苗定植次年生產的銀杏葉藥材進行質量測定，結果見表12.不同等級種苗生產藥材的內酯成分中銀杏內酯B、銀杏內酯C含量存在顯著差異，一級、二級苗含萜類內酯含量顯著高于三級和不合格苗.不同等級種苗生產藥材的黃酮成分中異鼠李素、山奈酚含量存在顯著差異，不合格苗總黃酮醇苷最高，顯著高于三級苗，一級苗總黃酮醇苷最低，與二級苗無顯著差異，顯著低于三級苗.不同等級苗葉片中含萜類內酯、總黃酮醇苷含量均達到藥典標準.

表11 不同等級葉用銀杏苗次年產量情況

表12 不同等級葉用銀杏種苗藥材活性成分的含量

4 討論與結論

本研究通過對重慶葉用銀杏育苗區30份葉用銀杏種苗的質量考察和分析，結合生產實際，選定株高、地徑、分枝率、一級側根數及平均分枝數作為重慶葉用銀杏種苗質量分級指標，將供試樣品分為3個等級標準：一級苗：株高≥70 cm，地徑≥9.5 mm，分枝率≥70%；二級苗：株高60～70 cm，地徑8.5～9.5 mm，分枝率35%～70%；三級苗：株高≥50 cm，地徑≥7.5 mm，分枝率≥12%；且各級苗一級側根≥15條，平均分枝數≥2枝.

本分級與主要造林樹種苗木質量分級標準略有差異，因根長度采挖時受人為因素影響較大，不能客觀定量，故未將根長納入分級指標[12].種苗定植次年高等級苗成活率、成活后長勢、生物量積累均高于低等級苗，與蔣冬生等研究結果一致[11]，說明優質種苗更利于提高定植后成活率及產量[14].總黃酮醇苷和總含萜內酯均為次生代謝產物，其形成機制復雜，受光照、水分、溫度等環境因素影響[15-16]，造成不同等級總黃酮醇苷及含萜內酯存在顯著性差異.鑒于不同等級種苗黃酮和萜內脂含量均超過藥典標準，說明此等級劃分具有可行性，生產上建議一、二級苗作為葉用銀杏種苗使用.

根據中藥材生產規范化需要，為推進中藥材種子種苗生產的標準化進程，近年來，中藥材種子種苗質量分級標準研究進展顯著.受植物生長特性影響，中藥材種子種苗分級標準研究報道中種子質量分級研究多于種苗質量分級研究，種子種苗質量分級研究則集中在一年生或多年生草本類藥材，如素花黨參[17]、黃連[18]、魚腥草[19]、甘草[20]等，木本類藥材種苗質量分級報道較少，僅見忍冬[21]、連翹[22]、刺五加[23]、枳殼[24]等藥材.然而，多年生藥材生產周期長，以花、果實、種子等入藥的多年生中藥材，投產周期均相對較長，種苗的品種及質量選擇尤為重要，優質的種子種苗能夠提高存活率，有效提前投產年限，因此中藥材種子種苗質量分級標準研究不容懈怠.