5種藥劑對大豆孢囊線蟲孵化及2齡幼蟲室內毒力的影響

姜偉，張海英，李金鴻，連蕓蕓，吳錦 ，劉永剛 ，李惠霞

(1.甘肅農業大學植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農業科學院植物保護研究所，甘肅省無公害農藥工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

大豆孢囊線蟲病(soybean cyst nematode，SCN)是由大豆孢囊線蟲(HeteroderaglycinesIchinohe)引起的植物內寄生性線蟲病害，具有分布廣、寄主范圍寬、孢囊存活時間長及危害嚴重等特點[1].該線蟲病害在世界各國大豆主產區均有發生，每年可造成高達30億美元的經濟損失[2].在我國，黑龍江、內蒙古、北京、江蘇、安徽、山西、山東、甘肅等20多個省相繼報道了該病害的發生和危害[3-4]，在東北和黃淮海大豆產區發生尤為嚴重，一般可造成30%以上減產，嚴重地塊甚至絕收[5].甘肅省大豆年播種面積約為11.5萬hm2，產區主要分布在隴東南.羅寧等[6]調查發現，甘肅省大豆孢囊線蟲發生比較普遍，主產區孢囊檢出率為63.7%～87.2%，且線蟲基數較高，平均孢囊數為1.2～11.4個/100 g土，對甘肅省大豆產業健康發展造成了嚴重威脅.

植物寄生線蟲，尤其是孢囊線蟲具有很強的繁殖能力與環境適應性，而生產中對于孢囊線蟲的防治主要以抗病育種為主，在缺乏有效抗源材料的背景下，化學藥劑仍然是目前防治大豆孢囊線蟲的重要手段.傳統的廣譜性殺線劑如涕滅威、克百威、滅線磷和甲基異柳磷等因為高毒、高殘留，造成嚴重的“3R”問題，已被禁用或限用[7-8].當前市場上非常缺乏防治大豆孢囊線蟲的專用殺線劑.因此，研制和篩選高效、安全、低毒的殺線劑防控大豆孢囊線蟲，顯得尤為迫切.二硫氰基甲烷是一種具有強烈殺菌殺線蟲活性的有機硫氰化合物，對多種病原真菌、細菌具有很好的生物學活性，但對于其殺線活性研究較少.本研究以大豆孢囊線蟲為試驗材料，測定了二硫氰基甲烷和4種常用藥劑對孵化、2齡幼蟲的毒力、運動行為和形態的影響，以期為新型殺線劑的開發和利用提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蟲源 供試線蟲采自甘肅省平涼市涇川縣大豆孢囊線蟲發生較嚴重地塊.將采集的病土帶回實驗室，采用漂浮法分離孢囊，并在體視顯微鏡下挑取飽滿的新鮮孢囊，于4 ℃保存備用.

1.1.2 供試藥劑 1.8%阿維菌素乳油，河北全德倫生化科技有限公司生產；20%噻蟲胺懸浮劑，江蘇輝豐生物農業股份有限公司生產；20%噻唑膦水乳劑，山東大農藥業有限公司生產；40%辛硫磷乳油，山東埃森化學有限公司生產；98%二硫氰基甲烷原藥，甘肅省農業科學院植物保護研究所提供.

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆孢囊線蟲2齡幼蟲懸浮液制備 2齡幼蟲懸浮液制備：將消毒的孢囊置于滅菌的孵化池中孵化，以滅菌水為孵化液，使水稍漫過孢囊為宜.在25 ℃培養箱黑暗條件下進行孵化，4 d后開始收集2齡幼蟲，根據試驗需要調整2齡幼蟲懸浮液濃度.

1.2.2 藥劑配制方法 將98%二硫氰基甲烷原藥溶于甲醇，1.8%阿維菌素乳油、20%噻蟲胺懸浮劑、20%噻唑膦水乳劑、40%辛硫磷乳油4種藥劑溶于無菌水，然后均配制成10 000 mg/L的母液，測定時用無菌水稀釋至所需系列濃度.各藥劑質量濃度設置依據試驗前期藥劑質量濃度篩選及推薦劑量.

1.2.3 5種藥劑處理對大豆孢囊線蟲孵化的影響 將新鮮飽滿的孢囊消毒后，置于6孔細胞培養板中進行藥液浸漬處理(每孔10個孢囊)，每孔藥液吸入1.5 mL，重復3次，以無菌水作為對照，并每天更換新的藥液，置于25 ℃培養箱中進行孵化.每3 d檢查1次，記錄2齡幼蟲數量；7 d后用無菌水清洗3～5次，將藥液更換為無菌水，每隔3 d在顯微鏡下觀察2齡幼蟲的孵化情況，統計數量，并更換新鮮孵化液.30 d后統計處理2齡幼蟲孵化數量，計算孵化抑制率.

1.2.4 5種藥劑對2齡幼蟲的毒力 在6孔細胞培養板中藥液浸漬處理線蟲，每孔加入1 mL大豆孢囊線蟲2齡幼蟲懸浮液(約100條)，然后加入1 mL不同質量濃度的藥液.以無菌水作為對照，每質量濃度重復3次，于25 ℃培養箱中進行培養.處理后24 h、48 h在體視顯微鏡下統計線蟲存活情況，計算死亡率和校正死亡率，并計算各藥劑的LC50和LC90.

1.2.5 二硫氰基甲烷與阿維菌素對2齡幼蟲運動行為的影響 根據毒力測定試驗結果，吸取5 mg/L二硫氰基甲烷與阿維菌素藥液各1 mL，將新鮮活躍的50條二齡幼蟲放入培養板中，分別處理1、6、12、24 h后，隨機選擇10條線蟲在體視顯微鏡下觀察1 min內線蟲運動情況.試驗以無菌水作為對照，每個處理進行3次重復.

運動行為測定參照Tsalik和Hobert的方法[9].線蟲頭部擺動頻率：在1 min內，線蟲頭部從一側擺向另一側后再擺動回來；線蟲身體彎曲頻率：在1 min內，線蟲的部分身體相對于身體長軸的改變次數.

1.2.6 二硫氰基甲烷與阿維菌素對2齡幼蟲形態的影響 分別吸取5 mg/L二硫氰基甲烷與阿維菌素藥液各1 mL于6孔細胞培養板中，加入50條線蟲藥液浸漬處理24 h后，各個處理隨機挑取10條線蟲置于載玻片上，熱殺死后于顯微鏡下拍照并測量線蟲體長、體寬、口針和尾部透明區長度.試驗以無菌水作為對照，每個處理進行3次重復.

1.3 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 22.0進行數據統計處理及分析.

2 結果與分析

2.1 5種藥劑處理對大豆孢囊線蟲孵化的影響

不同質量濃度處理后，5種藥劑均對大豆孢囊線蟲的孵化表現出抑制作用.其中，二硫氰基甲烷對孢囊線蟲的孵化抑制作用最強，且隨著藥劑質量濃度的增大，孵化抑制作用逐漸增強，在2.5～10 mg/L范圍內，孵化抑制率顯著高于其他藥劑，孵化抑制率為81.15%～96.86%.其次是阿維菌素，在高濃度下對孢囊線蟲的抑制率與二硫氰基甲烷相當.不同質量濃度噻唑膦對孵化的影響稍低，孵化抑制率為65.49%～79.58%.辛硫磷在低質量濃度下抑制作用較弱，但在高質量濃度下對孢囊內卵孵化的抑制作用與二硫氰基甲烷和阿維菌素無顯著差異.

表1 5種藥劑處理對大豆孢囊線蟲孵化的影響

2.2 5種藥劑對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲的毒力

試驗結果顯示，不同藥劑處理后，大豆孢囊線蟲2齡幼蟲死亡率顯著高于對照，且隨著處理時間及藥劑質量濃度的增加，2齡幼蟲的校正死亡率逐漸增大.其中2.5 mg/L二硫氰基甲烷藥液作用于2齡幼蟲48 h時，校正死亡率為64.26%.阿維菌素處理48 h時，2齡幼蟲校正死亡率為68.16%.隨著噻蟲胺和噻唑膦處理時間延長，線蟲校正死亡率呈直線上升，但二者差異不顯著.辛硫磷處理48 h后，80 mg/L時的校正死亡率為48.97%，效果顯著低于噻蟲胺和噻唑膦(表2).

以供試藥劑折百后的質量濃度為自變量，處理48 h線蟲校正死亡率為因變量，建立農藥毒力回歸方程.結果表明，5種藥劑對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲的毒力差異較大，其中阿維菌素和二硫氰基甲烷對2齡幼蟲表現出較強的殺線活性，顯著高于噻蟲胺、噻唑膦及辛硫磷.阿維菌素和二硫氰基甲烷的LC50值分別為1.072 7、1.135 5 mg/L，LC90值分別為15.638 7、11.662 7 mg/L(表3).

表2 5種藥劑對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲致死作用

2.3 二硫氰基甲烷與阿維菌素對2齡幼蟲運動行為的影響

由圖1～2可以看出，二硫氰基甲烷和阿維菌素均對2齡幼蟲運動行為有顯著的影響.隨著處理時間的延長，身體彎曲與頭部擺動頻率呈下降趨勢.與對照相比，5 mg/L的二硫氰基甲烷與阿維菌素處理12 h之后，2齡幼蟲身體彎曲頻率和頭部擺動次數顯著下降，表明二硫氰基甲烷和阿維菌素可影響2齡幼蟲運動行為，從而影響其移動和尋找寄主的能力.

表3 5種藥劑對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲的毒力

圖1 二硫氰基甲烷和阿維菌素對2齡幼蟲身體彎曲頻率的影響Figure 1 The effect of methylene bisthiocyanate and abamectin on the body bend frequency of the second-stage juveniles

2.4 二硫氰基甲烷與阿維菌素對2齡幼蟲形態的影響

結果顯示，二硫氰基甲烷與阿維菌素處理后，與對照相比，線蟲部分形態測量值差異顯著.表現為2種藥劑處理后，線蟲體長顯著縮短，體寬顯著變大，尾部透明區顯著縮短，但口針無顯著性差異.說明二硫氰基甲烷和阿維菌素處理后，線蟲在形態上發生了改變.

圖2 二硫氰基甲烷和阿維菌素對2齡幼蟲頭部擺動頻率的影響Figure 2 The effect of methylene bisthiocyanate and abamectin on the head swing frequency of the second-stage juveniles

表4 二硫氰基甲烷和阿維菌素對2齡幼蟲形態的影響

3 討論

化學防治仍是當前防治大豆孢囊線蟲病的重要手段.本試驗測試了5種藥劑對大豆孢囊線蟲孵化及2齡幼蟲的抑制作用，結果表明各藥劑均對孵化有抑制作用，對2齡幼蟲有致死作用，其中二硫氰基甲烷和阿維菌素對大豆孢囊線蟲孵化的抑制作用顯著，說明二硫氰基甲烷和阿維菌素較其他藥劑更容易穿透孢囊殼與卵殼，這與李秀花等[10]小麥孢囊線蟲的研究結果相似.

2齡幼蟲是侵染寄主植物的主要蟲態，低毒、高效的殺線劑能夠抑制2齡幼蟲，使其中毒死亡.本試驗中，5種藥劑對2齡幼蟲毒力研究結果表明，二硫氰基甲烷和阿維菌素對2齡幼蟲表現出強烈的殺線活性，其中5 μg/mL二硫氰基甲烷處理48 h時，2齡幼蟲死亡率可達80%.祁之秋等[11-12]報道了二硫氰基甲烷對根結線蟲2齡幼蟲的LC50為0.72 mg/L，當5 μg/mL的藥劑處理幼蟲36 h，死亡率可達100%，其效果優于本試驗，這可能與線蟲種類不同有關.已有研究表明，二硫氰基甲烷作為種衣劑，對水稻干尖線蟲和小麥孢囊線蟲病的田間防效顯著，且增產效果明顯[13-14].本試驗只測定了該藥劑對大豆孢囊線蟲的室內毒力，而田間防治效果還需進一步試驗和研究.

運動行為是反應線蟲神經系統基本功能的指標，已被廣泛應用于一些重金屬神經毒性的分析[15].本試驗中，通過身體彎曲和頭部擺動頻率，觀察二硫氰基甲烷和阿維菌素對2齡幼蟲運動行為的影響，發現當暴露藥劑處理24 h時，部分蟲體雖未死亡，但與對照相比，線蟲運動行為明顯減緩.頭部擺動與身體彎曲頻率隨藥劑質量濃度的增加呈下降趨勢，說明在藥劑作用下，可能損害運動相關神經元，從而抑制了線蟲的運動能力，對其移動和尋找寄主的能力也產生影響.與阿維菌素相比，二硫氰基甲烷處理后，線蟲反應遲鈍，運動功能受損嚴重，質量濃度越高，對線蟲毒害作用越強.

線蟲的體長、體寬等形態測量值的變化可直接反應其發育速度和生理狀況，是衡量線蟲發育情況的常用指標[16].本試驗測試了二硫氰基甲烷和阿維菌素急性暴露條件下對大豆孢囊線蟲形態測量值的變化，結果顯示，和對照相比，藥劑處理后的線蟲體長顯著減小，尾部透明區顯著變短.說明2種藥劑可使線蟲形態發生改變.

本試驗所選藥劑中阿維菌素、噻唑膦已成功登記用于根結線蟲的防治.阿維菌素作為一種神經毒劑抗生素類農藥，除對根結線蟲有較好的防治效果外，亦對孢囊線蟲有作用.在本研究中，噻蟲胺作為新煙堿類中的一種殺蟲劑，對孢囊孵化和2齡幼蟲毒殺均有一定影響，可與其他藥劑復配使用來防控大豆孢囊線蟲及其他地下害蟲.噻唑膦對孢囊線蟲殺線活性較低，這是否與線蟲種類、藥劑劑型及當地用藥歷史有關需要進一步研究.傳統的殺蟲劑辛硫磷雖然對孢囊線蟲也有一定防效，但由于殘留期太長，且防效易產生抗藥性[17]，所以不推薦應用于孢囊線蟲的防治.二硫氰基甲烷作為一種揮發性、具有強烈殺菌、殺線蟲活性的有機硫氰化合物，長時間作用線蟲后，能夠使蟲體溶解和死亡.研究表明，二硫氰基甲烷作為一種新型殺線劑，對南方根結線蟲(MeloidogyneincongnitaChitwood)殺線活性強[18]，但目前對于該藥劑防治孢囊線蟲的研究還較少，對于其分解產物中的活性成分及作用機理有待后續深入研究.

4 結論

本試驗所選藥劑對大豆孢囊線蟲孵化有抑制作用，對2齡幼蟲有致死作用.其中二硫氰基甲烷作用效果最好，在質量濃度為5 mg/L時，孢囊內卵孵化抑制率達90.31%，顯著高于其他藥劑.毒力試驗結果顯示，10 mg/L的二硫氰基甲烷浸漬處理線蟲48 h，校正死亡率為88.55%，LC50為1.135 5 mg/L，殺線活性強，且該藥劑影響線蟲活動行為，2齡幼蟲形態發生了改變.因此，二硫氰基甲烷是一種具有防治作用的新型藥劑，有望進一步開發利用.