合作豬夏冬季的腸道菌群結構

裴利君，楊巧麗，王鵬飛，滾雙寶，2

(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現代養豬工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070)

動物的腸道內存在著數量龐大、種類多樣的共生微生物群，該群落由細菌、古生菌、病毒、真菌和原生動物組成，其中細菌占主要地位，通常稱為腸道菌群[1].腸道菌群與宿主免疫、營養代謝以及其他生命活動緊密相關，如：通過發酵分解食物以及腸道上皮細胞分泌的黏液及形成高效蛋白分解機制等參與機體的消化代謝[2]；通過促進機體的免疫系統發育成熟、形成腸黏膜屏障、維持腸道免疫穩態等維持機體的免疫功能[3]；在腸道與大腦的交互中，通過“菌群-腸-腦軸”調節腸道功能，促進血腦屏障的發育和動物對寒冷環境的適應等[4].腸道菌群在長期進化過程中，通過個體的適應和自然選擇，菌群、宿主與環境之間，始終處于動態平衡狀態中，相對穩定的微生物菌群對維持機體內環境穩態和健康具有重要意義[5].

腸道菌群與宿主遺傳和環境因素有關.研究表明，動物腸道菌群結構受季節、食性、外界環境等的影響.肖文萍[6]研究發現，藏豬夏季和冬季之間腸道微生物相似性僅為0.44，藏豬腸道內優勢微生物有30多種，比長白豬腸道內優勢微生物(約20種)更具多樣性；且藏豬體內具有相對豐富的降解纖維素或半纖維素功能的微生物.白浩男[7]研究發現相比于其他豬種，藏豬腸道中擬桿菌門(Bacteroides)、螺旋體門(Spirochaetes)細菌相對豐度較高，而厚壁菌門(Firmicutes)、腸桿菌科(Enterobacterlaceae)細菌相對豐度較低，其獨特的菌群結構可能與其草食、抗病的特性相關.吳麗娟等[8]研究發現藏豬腸道內微生物菌群的復雜多樣性在很大程度上源于其食草的特性、特殊的生存環境以及長期散養的飼喂方式.在其他物種上，也有研究表明腸道菌群多樣性和組成與其高海拔及寒冷適應性有關.Li等[9]發現，與平原鼠兔相比，高原鼠兔具有多樣性更為豐富且植物多糖消化能力較強的腸道菌群以適應高原環境.Li等[10]使用抗生素造成小鼠腸道菌群缺失，發現小鼠體溫調控機制受到了破壞，進一步研究發現，腸道菌群的缺失減少了棕色脂肪中UCP-1蛋白的表達量，降低了白色脂肪的棕色化水平，另外該結果在無菌小鼠中也得到了證實，說明腸道菌群在寒冷環境下可對動物的體溫調控機制產生影響.由此可見，腸道菌群在機體適應環境變化方面具有重要作用.

合作豬，又稱蕨麻豬，是甘肅省高寒牧區放牧或半放牧飼養的一個藏豬類群，主產于甘肅省甘南州的合作、夏河、卓尼、碌曲、迭部等縣(市)[11].合作豬生活在青藏高原海拔2 500～3 500 m的低氧環境，以放牧或半放牧方式飼養，春冬季節采食蕨蔴及蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)、苦豆(SophoraalopecuroidesL.)、防風(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schisch)、珠芽蓼(PolygonumviviparumL.)等植物的根莖，夏秋季在草原上采食牧草及落果落粒[12].研究高原低氧環境下半放牧飼養合作豬腸道菌群結構對深入了解該品種及其消化道菌群特性具有重要意義.然而，目前關于合作豬腸道菌群的研究鮮有報道.

因此，本項目以合作豬為研究對象，采用16S rRNA高通量測序技術，比較分析甘肅高寒牧區半放牧飼養條件下合作豬夏季和冬季腸道中細菌的多樣性和組成差異，深入了解合作豬品種特性，并為后續研究和開發利用合作豬抗寒、抗逆和耐粗飼等優良特性相關的腸菌資源提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2019年1月(冬季，TW)和2019年8月(夏季，TS)選擇在甘肅省甘南藏族自治州夏河縣農戶半放牧的6月齡健康合作豬，每個季節各6頭，共12頭.試驗豬每日早晨(8∶00)開始放牧，夏季自由采食蕨麻草(Radixpotentillaeanserinae)、車前草(PlantaginisHerba)、野蘿卜(RaphanusrapanistrumL.)、野苜蓿(MedicagofaloataL.)、早熟禾(PoaannuaL.)和莎草(CyperusrotundusL.)等野生植物的莖葉和籽實，冬季自由采食蕨麻和野生植物根莖；在傍晚歸牧后(夏季20∶00、冬季18∶00)補飼一次，補喂飼料為：草粉0.26 kg/(頭·d)、玉米面0.05 kg/(頭·d)及青稞面0.18 kg/(頭·d).

在豬補喂飼料后排便時，使用無菌棉簽收集其新鮮糞便內部未與地面和空氣接觸的部分作為樣品，分裝于5 mL無菌離心管中，經液氮速凍后，帶回實驗室-70 ℃保存.

1.2 糞便細菌總DNA的提取與檢測

1.3 16S rRNA基因V3-V4區的擴增與產物回收

選擇16S rRNA基因的V3-V4高變區作為擴增和測序的目的片段.以細菌基因組DNA為模板，采用兩端帶有barcode的特異引物(314F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAAT -3′)進行PCR擴增.PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；用Invitrogen/QuantiFluorTM-ST熒光定量系統進行PCR產物定量檢測.根據所得PCR產物的濃度進行等量混樣，重新用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對目的產物條帶使用膠回收試劑盒回收.

1.4 文庫構建和16S rRNA基因測序

1.5 測序數據處理及統計分析

使用FLASH軟件對樣品reads進行拼接，得到原始tags數據(Raw tags)，參照Qiime(V1.7.0)的tags質量控制流程對raw tags過濾，得到有效tags數據(Effective tags).以97%的序列一致性水平，利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)對effective tags進行聚類和物種分類分析，生成OTUs；以出現頻數最高的序列為OTUs的代表序列，用RDP Classifier(Version 2.2)貝葉斯算法將OTU代表序列與GreenGenes細菌數據庫比對進行物種注釋，得到對應的物種信息和物種的豐度.

使用Qiime軟件統計分析α多樣性指數，包括Observed-species，菌群多樣性Shannon和Simpson指數，菌群豐度ACE指數.基于各樣品序列間的進化信息的差異計算Unifrac距離，采用Qiime軟件計算樣品間β多樣性距離，使用UPGMA算法構建層次聚類樹.采用t.test統計方法進行組間樣本菌群組成和多樣性的差異顯著性分析.

2 結果與分析

2.1 OUT統計分析和物種注釋

對測序獲得的下機數據進行拼接、質控和嵌合體過濾后得到766 363條高質量有效序列(Effective tags)，平均每個樣本reads數為63 864，reads的平均長度為412 bp.對所有樣品的effective tags以97%的一致性(identity)進行聚類，共獲得2 359 OTUs.選取OTUs的代表序列進行物種注釋，所有樣品共注釋了25個門、42個綱、80個目、144個科、249個屬和184個種.

得到OTUs后，通過繪制稀釋曲線(rarefaction curve)來直接反映測序數據量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度.如圖1所示，所有樣品的稀釋曲線已經趨于平緩，說明本次試驗的數據量可靠.

圖1 合作豬腸道菌群稀釋曲線Figure 1 The rarefaction curve of intestinal microbiota of Hezuo pigs

2.2 合作豬主要糞便微生物結構組成

合作豬夏季和冬季糞便微生物在門水平排名前10的物種見圖2.厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和螺旋體門(Spirochaetes)是組成合作豬冬季和夏季糞便菌群的主要細菌門類，其相對豐度比例占總細菌門95%以上.其他主要細菌門依次為變形菌門(Proteobacteria)、廣古菌門(Euryarchaeota)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、軟壁菌門(Tenericutes)和藍藻菌門(Cyanobacteria).

圖2 合作豬冬季和夏季腸道菌群主要細菌門的相對豐度Figure 2 Relative abundance of main bacterial phylum of intestinal microbiota of Hezuo pigs between winter and summer

合作豬夏季和冬季糞便微生物在屬水平排名前10的物種見圖3.在注釋的細菌屬中，有46個屬的相對豐度大于0.1%，約占總細菌比例的16.7%，其中，unidentified_Clostridiales細菌屬和Terrisporobacter在夏季合作豬和冬季合作豬中均占有較高比例，但夏季合作豬糞便菌群中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和unidentified_Prevotellaceae細菌屬的相對豐度較高，分別是冬季合作豬的4.2倍和2.9倍，其他排名前10的主要細菌屬有unidentified_Ruminococcaceae細菌屬、Romboutsia、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、Acetitomaculum、鏈球菌屬(Streptococcus)、Turicibacter和Lactobacillusnidentified_Clostridiales.

圖3 合作豬冬季和夏季腸道菌群主要細菌屬的相對豐度Figure 3 Relative abundance of main bacterial genus of intestinal microbiota of Hezuo pigs between winter and summer

2.3 合作豬糞便菌群多樣性

夏季合作豬和冬季合作豬糞便菌群α多樣性組間差異分析結果見圖4.由圖可見，合作豬腸道菌群ACE指數、Observed species、Simpson和Shannon指數在冬季與夏季間均差異不顯著(P>0.05).

圖4 合作豬冬季和夏季腸道菌群α多樣性分析Figure 4 The α diversity of intestinal microbiota of Hezuo pigs between winter and summer

基于所有樣品的物種注釋結果和OTUs的豐度信息，通過樣品UPGMA聚類樹分析各樣本及分組間的相似度，結果發現，同組內樣品距離最近(圖5-A)，說明組內樣品相似度最高；基于weighted unifrace distance的β多樣性指數分析發現夏季合作豬β多樣性極顯著低于冬季合作豬(圖5-B)，說明與冬季相比，夏季合作豬個體間糞便微生物群落均勻度較一致.

2.4 合作豬冬季與夏季組間主要差異細菌

采用t.test方法分析門和科水平上合作豬冬季與夏季主要糞便微生物菌群(夏季或冬季的平均相對豐度>0.1%)組成差異，結果見圖6.在門水平，冬季合作豬糞便菌群廣古菌門(Euryarchaeota)相對豐度顯著高于夏季(P<0.05).在科水平，夏季合作豬糞便菌群中鏈球菌科(Streptococcaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)和消化球菌科(Peptococcaceae)的相對豐度顯著高于冬季(P<0.05)，除了普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)外，其他4個細菌科均屬于厚壁菌門(Firmicutes)；冬季合作豬糞便菌群中甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)的相對豐度顯著高于夏季(P<0.05).

為了進一步挖掘合作豬適應飼草環境變化的主要腸道微生物，我們分析了在種水平上顯著差異的細菌(圖7)，發現了擬普雷沃菌309(Alloprevotella_sp_feline_oral_taxon_309)、梭菌目細菌ID5(Clostridium_sp_ID5)、柏林密螺旋體(Treponema_berlinense)和溶紙梭菌(Clostridiumpapyrosolvens)在夏季合作豬糞便菌群中的相對豐度均顯著高于冬季(P<0.05)；反芻甲烷桿菌(Methanobrevibacter_ruminantium)、瘤胃菌屬細菌YS3(rumen_bacterium_YS3)以及毛螺旋菌科細菌YE64(bacteriumYE64)在夏季合作豬糞便菌群中的相對豐度均顯著低于冬季(P<0.05).

圖6 合作豬冬季和夏季組間顯著差異主要細菌門和細菌科Figure 6 The main bacterial phyla and bacterial families with significant differences of Hezuo pigs between winter and summer

3 討論

合作豬是我國高原型地方豬種藏豬的一個類群，因其常年在甘肅省高寒牧區放牧或半放牧飼養，形成了耐粗飼、耐低氧和高寒以及抗病力強的特點.本研究樣品采集地點為甘南藏族自治州西北部夏河縣，屬大陸高原性氣候.7月(夏季)均溫為12.7 ℃，處于全年降水集中期，氣候潮濕，植被豐富，蕨麻豬主要采食各種牧草、植物的青綠莖葉及落果籽實；1月(冬季)均溫為-9 ℃，處于枯草期，氣候寒冷，牧草資源較為缺乏，合作豬主要采食蕨蔴及蒲公英、苦豆、防風、珠芽蓼等植物的根莖[13-16].本研究對6月齡合作豬夏季和冬季糞便菌群多樣性和組成進行分析發現，合作豬夏季和冬季糞便菌群α多樣性差異不顯著(P>0.05)，而夏季合作豬糞便菌群β多樣性顯著低于冬季(P<0.05)，這與李卓君[17]的研究結果一致，其原因可能與合作豬冬春季采食蕨蔴、草根，夏秋季在草原上采食牧草及落果落粒的特性有關，合作豬可能通過豐富腸道菌群的多樣性來提高冬季對高纖維飼料的消化利用能力；也可能是合作豬對冬季冷適應的表現，有研究表明，降低環境溫度后，布氏田鼠不僅增加了攝食量和產熱，同時改變了腸道菌群的結構來抵抗寒冷[4].對合作豬夏季和冬季腸道菌群組成分析發現，在門水平，合作豬夏季和冬季糞便菌群中優勢菌門的分布基本相同，按相對豐度大小依次為厚壁菌門、擬桿菌門和螺旋體門，這3個細菌門占合作豬糞便總細菌的比例分別為66.76%、27.11%、4.65%，這與王芳等[18]、Shang等[19]的研究結果一致.然而，在Jiang等[20]的研究中，6月齡時藏豬糞便菌群中擬桿菌門比例最高，其次是厚壁菌門，分別約占總細菌數的50%和30%左右，這種結果差異可能與試驗豬種飼養環境和飼養方式不同有關.厚壁菌門(Firmicutes)是豬正常腸道菌群的一大類細菌[21]，該細菌門的主要成員能通過碳水化合物代謝產生短鏈脂肪酸，在機體能量獲得和免疫應答調節中發揮重要作用[22-23].擬桿菌門(Bacteroidetes)是腸道革蘭氏陰性菌中數量最大的一類細菌[24]，該細菌門的主要成員具有較強的分解多糖的能力[25].螺旋體門(Spirochaetes)也是成年豬腸道菌群的主要細菌門類之一，能夠降解果膠、纖維素和磷酸酯等，發酵碳水化合物生成短鏈脂肪酸為動物機體提供能量[26].在屬水平上，梭菌屬(unidentified_Clostridiales)和Terrisporobacter為合作豬糞便菌群中的優勢細菌屬，其他主要細菌屬有unidentified_Ruminococcaceae細菌屬、Romboutsia、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、Acetitomaculum、鏈球菌屬(Streptococcus)、Turicibacter和Lactobacillusnidentified_Clostridiales.除歸屬于厚壁菌門消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)的Terrisporobacter和Romboutsia外，其他幾種細菌被報道在藏豬和民豬糞便細菌屬中占主要比例[17,27].說明這些菌群可能與合作豬能夠消化利用粗飼料的特性有關.與冬季合作豬相比，夏季合作豬糞便菌群中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和unidentified_Prevotellaceae細菌屬的相對豐度較高，這可能與合作豬不同季節的采食變化相關.unidentified_Prevotellaceae細菌參與淀粉的降解，與葡萄糖代謝呈正相關，具有分解黏蛋白質、降解多糖的功能[28]；乳酸桿菌屬(Lactobacillus)是重要的益生菌，不僅可以調節腸道菌群平衡維持腸道健康發育抑制有害菌生成，還能夠有效分解食物中的蛋白質和糖類，合成維生素，而且對脂肪也有微弱的分解能力，從而可以促進消化吸收[29].因此我們推測，在夏季，較豐富的乳酸桿菌(Lactobacillus)和unidentified_Prevotellaceae有利于合作豬在夏季對牧草落果、落粒等食物中的淀粉、糖類和蛋白的降解.在種水平上，我們發現，擬普雷沃菌309(Alloprevotella_sp_feline_oral_taxon_309)、梭菌目細菌ID5(Clostridium_sp_ID5)、Treponema_berlinense和溶紙梭菌(Clostridiumpapyrosolvens)在夏季合作豬糞便菌群中的相對豐度均顯著高于冬季合作豬(P<0.05).其中，溶紙梭菌(Clostridiumpapyrosolvens)是一種厭氧纖維素降解細菌，能產生具有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶活性的纖維小體，高效地降解果膠質、蛋白質和纖維類物質[30].反芻甲烷桿菌(Methanobrevibacter_ruminantium)、瘤胃菌屬細菌YS3(rumen_bacterium_YS3)以及毛螺旋菌科細菌YE64(bacteriumYE64)在夏季合作豬糞便菌群中的相對豐度均顯著低于冬季(P<0.05).其中，毛螺旋菌科細菌具有降解毒素、抵制致病菌感染的作用[31]，有利于合作豬在冬季疾病高發期提高對病原菌的抵抗力；瘤胃菌屬細菌是主要分布于食草動物體內具有分解纖維素能力的細菌[32]；甲烷桿菌(Methanobrevibacter_ruminantium)在單胃動物后腸的微生物發酵中起著重要的作用，其能利用微生物發酵產生的氫和二氧化碳生成甲烷，從而使后腸維持較低的氫氣壓，并促進有機物質的降解[33].說明這些菌群有利于提高合作豬對冬季高纖維性食物的消化，獲取更多的能量滿足在寒冷的氣溫下自身產熱的需要.

圖7 合作豬冬季和夏季組間顯著差異主要細菌種Figure 7 The main bacterial species with significant differences of Hezuo pigs between winter and summer

4 結論

綜上所述，合作豬腸道菌群的組成受不同季節氣候和飼草特性的影響而呈現季節性差異變化，冬季以富含纖維分解的細菌為主，夏季以降解碳水化合物和蛋白等營養的細菌為主.研究結果為探討合作豬抗逆、抗病和耐粗飼等優良特性形成機理和更好地開發和利用合作豬種質資源特性提供了重要參考.