河蟹疾病的細菌檢測及藥敏試驗

○劉殿如 宮子慧

我縣臨淮鎮2個塘口的養殖戶河蟹出現了死亡的現象，病蟹主要表現為活力差、吃食減少甚至不吃食、肝胰腺病變、鰓發黑。筆者通過對病蟹肝胰腺進行細菌分離、鑒定和藥物敏感試驗等研究，以期為河蟹養殖細菌性疾病的病原和防控提供科學數據和理論基礎，有效地防止藥物的濫用和誤用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

來自泗洪縣臨淮鎮的2個發病的養殖塘口，采集的病蟹用采樣箱加冰低溫運送到實驗室。

腸桿菌和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）（英文名API 20E）、氧化酶試劑購自梅里埃診斷產品（上海）有限公司，動物用藥敏分析試劑板購自南京菲恩醫療科技有限公司，營養瓊脂購自北京路橋。

1.2 方法

（1）病原菌的分離。用滅菌棉簽蘸取河蟹肝胰腺，均勻涂于營養瓊脂培養基上，置于28℃恒溫培養18-24h后，觀察菌落形態，并挑取可疑單個菌落劃線接種在營養瓊脂平板上，置于28℃恒溫培養18-24h。

（2）生理生化特性。采用腸桿菌和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）系統測定各分離菌株生理生化特性。具體方法為用滅菌吸管挑取單菌落至0.85%NaCl中，制成0.5麥氏單位的菌懸液，并用吸管將菌懸液加到API 20 E試劑條的20個含干燥底物的微量小管中，使小管內底物溶解。CIT、VP、GEL小管，菌液需充滿管部和杯部，其他管僅充滿管部，ADH、LDC、ODC、H2S、URE小杯內加入礦物油以形成厭氧環境。蓋上培養盒，于36±2℃孵育18-24h，同時做氧化酶反應構成第21個試驗。孵育后，根據判讀表判讀各反應結果，參照生化譜檢索手冊，得到鑒定結果。

（3）病原菌的藥敏試驗。挑取單菌落于5mL生理鹽水中制成0.5麥氏單位的菌懸液（A管），從中吸取0.1mL，加入到10mL無菌生理鹽水中混勻（B管）。將B管菌液倒入經滅菌的V形槽內制備成B液。利用微量移液器吸取B液，加入藥敏板所有的微孔中，每孔0.1mL，分別測定細菌分離株對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、紅霉素、鹽酸環丙沙星、鹽酸土霉素、強力霉素共8種常見藥物的敏感程度。蓋好試劑板，置于35℃培養箱培養18-24h，經肉眼觀察證實無細菌生長試管中的最低藥物濃度，即為藥物的最小抑菌濃度（minimum in‐hibitory concentration，MIC）。

2 結果

2.1 病原菌分離及形態特征觀察

從病蟹肝胰腺分離到的細菌在營養瓊脂平板上為光滑、濕潤、微凸、乳白色或淡黃色菌落。

2.2 病原菌的氧化酶實驗和生理生化鑒定

對分離得到的5株細菌進行生理生化檢測，結果判定：分別為嗜水氣單胞菌-1(細菌編碼：7247124)、嗜水氣單胞菌-2(細菌編碼：7247165)、嗜水氣單胞菌-3(細菌編碼：7246105)、腐敗希瓦菌、解藻朊酸弧菌，具體生理生化特性見表1。

表1 鑒定試劑條檢測結果

2.3 病原菌的藥敏試驗結果

參照2013年抗菌藥物敏感性試驗執行標準，5株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度如表2所示。

表2 5株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）對照 mg/L

3 討論與分析

從2個塘口的病蟹分離到5個細菌分離株，根據其培養后的菌體形態特征、生理生化特性，分別確定為致病性嗜水氣單胞菌3株、腐敗希瓦菌、解藻朊酸弧菌。通過藥敏試驗，嗜水氣單胞菌-1、腐敗希瓦菌對紅霉素耐藥，對其余7種抗菌藥物敏感；嗜水氣單胞菌-2對硫酸新霉素、強力霉素敏感，對恩諾沙星、鹽酸土霉素中敏，對甲砜霉素、氟苯尼考、紅霉素、鹽酸環丙沙星耐藥；嗜水氣單胞菌-3對恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環丙沙星、鹽酸土霉素、強力霉素敏感，對硫酸新霉素中敏，對紅霉素耐藥；解藻朊酸弧菌對甲砜霉素耐藥，對其余7種抗菌藥物敏感。在水產養殖用藥過程中，通過藥敏試驗，選擇合理的抗菌藥物種類，對建立正確合理用藥機制具有實際意義。

（通聯：223935，江蘇省泗洪縣臨淮鎮政府手機：13815762979）