異丙酚對熱損傷小鼠氧化應激損傷的保護效應探究

陳石生

（南方醫科大學南方醫院太和分院內科 廣東廣州510540）

中暑屬于急性熱致疾病，表現為中心體溫迅速升高至40℃以上，伴有中暑神經功能障礙，嚴重時可引起多臟器功能障礙綜合征（MODS），具有較高的致殘率、病死率[1]。高熱可造成人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）發生氧化應激反應，增加細胞內活性氧（ROS）生成，介導內皮細胞損傷，引起細胞毒性改變，誘發細胞凋亡[2~3]。異丙酚是一種短效、快速的鎮靜藥，具有不良反應少、易喚醒、起效快等優點，同時可抑制細胞內ROS生成，減輕細胞損害[4]。但異丙酚是否能夠有效改善熱損傷所致的氧化應激損傷研究較少。本研究分析異丙酚對熱損傷小鼠氧化應激損傷的保護效應，為臨床治療提供新思路。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器Gibco公司的胎牛血清（FBS）、胰酶、雙抗；購自ThermoScientificTM公司的ROS、酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒；Caspase活性檢測試劑盒（Biovision公司）；英國Astra Zeneca公司提供的異丙酚；流式細胞儀（美國BD公司）；脂肪乳購自輔仁藥業集團有限公司；酶標儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 實驗動物SPF級BALB/c小鼠，雄性，6~8周齡，體質量25~30 g，購自南方醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2011-0015。1.3模型制作與分組 按隨機數字表法將BALB/c小鼠分為37℃組、37℃+異丙酚組、37℃+脂肪乳組、43℃組、H2O2+異丙酚組、43℃+異丙酚組6組，每組10只。HUVECs鋪入細胞培養皿內，密度1.0×105/ml，置入43℃細胞培養箱內實施2 h熱打擊，隨后以5%CO2、37℃常規培養6 h，創建HUVECs熱打擊模型。37℃+脂肪乳組：在含10%脂肪乳培養基內置入細胞，時間為6 h；37℃+異丙酚組：在含50 μM異丙酚培養基內置入細胞，時間為6 h；43℃+異丙酚組：在含50 μM異丙酚培養基內置入細胞，時間為6 h，隨后實施熱打擊；H2O2+異丙酚組：細胞先用200 μM H2O2預處理，再置入含50 μM異丙酚培養基內置入細胞，時間為6 h。

1.4 細胞活力檢測 用WST-1法檢測，各組處理后放置在孵育箱（37℃）內培養6 h，分別在96孔板的每孔內加入約10 μl WST-1，置于細胞培養箱內孵育2 h。用酶聯免疫檢測儀讀取450 nm處的OD值，判斷細胞活力。

1.5 ROS檢測 用熒光探針法測定主動脈內皮ROS表達。按照試劑盒處理主動脈內皮組織，均漿，冷PBS重懸，加入適量熒光探針DHE，37℃、避光孵育30 min，細胞內ROS變化用流式細胞儀測定，激發、發射波長分別為353 nm、515 nm。

1.6 ATP含量檢測 用熒光素-熒光素酶法，將對數生長期HUVECs鋪入96孔板，每孔5×103，細胞貼壁穩定后進行上述分組處理，為獲得背景數值，另準備對照孔，只含HPSS液，不含細胞。每孔內加入與細胞懸液等體積的熒光素酶試劑，室溫避光，孵育10 min，穩定熒光，用多光譜微孔板閱讀器分析熒光強度。

1.7 Caspase活性檢測 取對數生長期、生長狀態良好的HUVECs實施分組處理，收集細胞，PBS沖洗，重復3次，滴加50 μl細胞裂解液，4℃下作用10 min，對樣品裂解，以12 000 r/min轉速離心操作1 min，取上清液。分別在每個細胞樣品內加入Caspase底物Ac-DEVD-AMC，37℃下孵育2 h，對Caspase-3/9活性檢測。用酶標儀讀取405 nm的OD值。

1.8 統計學方法 應用SPSS21.0軟件分析數據，用（±s）表示計量資料，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞活力對比37℃各組細胞活力對比，無統計學差異（P＞0.05），43℃組細胞活力低于37℃組，且H2O2+異丙酚組、43℃+異丙酚組細胞活力高于43℃組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細胞活力對比

2.2 各組細胞內ROS情況對比37℃各組細胞內ROS含量對比，無統計學差異（P＞0.05）；43℃組細胞內ROS含量高于37℃組，H2O2+異丙酚組、43℃+異丙酚組細胞內ROS含量低于43℃組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞內ROS情況對比

2.3 各組細胞內ATP情況對比37℃各組細胞內ATP含量對比，無統計學差異（P＞0.05）；43℃組細胞內ROS含量低于37℃組，43℃+異丙酚組、H2O2+異丙酚組細胞內ATP含量高于43℃組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組細胞內ATP情況對比

2.4 各組細胞Caspase-3、Caspase-9活性情況對比37℃各組細胞內Caspase活性對比，無統計學差異（P＞0.05）；43℃組細胞 內Caspase-3/9活性高于37℃組，43℃+異丙酚組、H2O2+異丙酚組細胞內Caspase-3/9活性低于43℃組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組細胞Caspase-3、Caspase-9活性情況對比

3 討論

中暑的病理生理學反應除熱暴露直接損傷外，繼發于熱損傷后全身炎癥反應綜合征更為關鍵，能進展為“類膿毒癥”反應，誘發MODS過程[5]。在早期熱損傷中血管內皮細胞（VECs）占有重要地位，既是熱損傷效應器官，可覆蓋于全身器官血管內皮和循環系統，又是熱損傷的放大器官，其損傷能夠引起凝血激活、炎癥放大，損傷各種器官功能[6~7]。另外，VECs會減少內皮表面糖包和內皮細胞生成活化蛋白C等抗凝成分，增加vWF等促凝成分，促使血小板活化，促進微血栓形成，減少組織灌注，誘發臟器功能障礙，并會造成內皮損害加重，形成惡性循環，最終誘發MODS。

ROS是中暑過程中VECs損傷的重要方式之一，熱損傷早期會損傷細胞DNA，增加細胞內ROS爆發性，損傷線粒體，造成細胞死亡。使用ROS特異性抑制劑能夠使細胞內ROS水平，逆轉熱損傷所致的細胞損傷[8]。本研究結果提示在熱損傷過程中，異丙酚可發揮抗凋亡、抗氧化損傷、保護線粒體作用。異丙酚起效迅速，用藥后可迅速穿過細胞膜，廣泛分布至全身各器官組織內，可使自由基對ATP的損傷減輕，抑制鈣超載，有助于線粒體呼吸功能改善，還能影響線粒體脂質過氧化過程，防止線粒體內膜流動性改變、通透性增高，對線粒體膜結構形成保護[9~10]。異丙酚可使熱損傷引起的內皮細胞氧化損傷減輕，增加內皮細胞線粒體膜電位、MPTP穩定性，提高細胞內ATP水平，對Caspase介導的線粒體凋亡通絡形成抑制，阻礙其活化，進而改善內皮細胞線粒體功能。另外，異丙酚還能經抑制中性粒細胞呼吸爆發、調節細胞內鈣離子平衡、減少自由基生成、抑制炎癥介質與細胞因子表達等發揮抗氧化作用。

綜上所述，在熱損傷過程中，異丙酚可發揮抗凋亡、抗氧化損傷、保護線粒體作用。