動物雙歧桿菌A12的腸道動態分布規律及其對便秘緩解效果研究

馬京升，任培豪，任 穎，金君華，劉 慧

(北京農學院食品科學與工程學院/食品質量與安全北京實驗室，北京 102206)

人體腸道內存在大量細菌定殖在腸道黏膜表面，與腸道黏膜細胞共同構成生物屏障，保護機體健康。已有研究證明，服用外源性益生菌，對維持機體微生態平衡、抑制病原微生物侵襲、調節免疫預防方面有重要作用[1]。然而口腔中各種消化酶、腸道中的強酸高膽鹽環境給益生菌的生存帶來很大的壓力，所以，益生菌要定殖在腸道黏膜表面，與宿主共同抵制外來致病微生物的侵襲，就必須克服重重阻力。在口服益生菌后，了解其在胃腸道中各部分不同時間點的總菌細胞數和活菌細胞數，及連續口服一段時間后，菌細胞在機體內的保留與排空情況很有必要。不同菌種甚至不同菌株之間穿過胃腸道的能力有所不同[2]，所以在評價一株益生菌時，了解其穿過胃腸道并存活的能力以及其分布和數量尤為重要。

FENG等[3]應用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術分別檢測便秘患者糞便標本和結腸黏膜菌群發現，糞便標本中雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬水平明顯低于健康人群，結腸黏膜中雙歧桿菌屬存在相同的變化。此外，一項羅馬基金會的研究報告顯示，便秘型腸易激綜合征患者腸道菌群改變主要表現為雙歧桿菌屬、梭菌屬和柔嫩梭菌屬顯著減少[4]。大量研究表明，補充含有雙歧桿菌的混合益生菌制劑可預防或治療便秘，但單菌株雙歧桿菌的緩解便秘作用效果不確定[5]，有研究發現單獨使用乳酸雙歧桿菌NCC2818對治療功能性便秘無效[6]。

前期研究結果表明，動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)A12可以顯著控制大鼠由于高糖高脂食物引起的血糖升高及體質量增加等癥狀[7]，具有良好的商業化應用前景，但該菌株在胃腸道的存活及其對腸道功能的影響尚未研究報道。

本研究以動物雙歧桿菌A12為研究對象，基于大鼠腸道菌群環境下，設計動物雙歧桿菌A12特異性引物，檢測一次攝入該菌株后，其在腸道各部位的動態存活細胞數，及連續攝入后其在腸道的存活時間，探討動物雙歧桿菌A12在腸道動態分布規律；進一步利用小鼠便秘模型，探討該菌株緩解功能性便秘的能力，為具有中國自主知識產權雙歧桿菌菌株產業化開發提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 菌株及處理方法

動物雙歧桿菌A12(北京農學院食品科學與工程學院食品微生物功能開發團隊自主分離，保存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCC 17308)，分離于母乳喂養嬰兒腸道。

動物雙歧桿菌A12活菌細胞：將動物雙歧桿菌A12在改良MRS培養基中，37 ℃厭氧培養，每12 h做一次傳代活化，將活化好的3代菌培養液，倒入離心管中5 000 r/min離心15 min，將離心好的動物雙歧桿菌A12沉淀重懸于等體積的生理鹽水中備用。

動物雙歧桿菌A12死菌細胞：按照“1.1”中配置動物雙歧桿菌A12活菌細胞的方法，得到重懸于生理鹽水中有活性的動物雙歧桿菌A12菌液后，再用滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，得到死菌細胞所需要的菌液。

1.2 試驗動物

用于菌株腸道分布研究：SPF級SD大鼠(質量合格證編號1103241911037614)，42日齡，雄性，體質量250～260 g，購于北京興隆動物廠，飼養于北京農學院食品科學與工程學院微生物實驗室動物房，室溫24 ℃，12 h光照/黑暗循環，自由飲水攝食，每天補充大鼠維持飼料，購自北京興隆動物廠。

用于便秘緩解作用研究：SPF級Balb/c雄性小鼠(質量合格證編號1103241911038195)，42～56日齡，體質量18～22 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司。飼養于北京農學院食品科學與工程學院微生物實驗室動物房，室溫24 ℃，12 h光照/黑暗循環，每天補充小鼠基礎飼料，購自北京興隆動物廠。

該試驗已通過北京農學院動物福利與倫理審查，編號為BUA2020112。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株腸道分布研究的分組處理方法 大鼠在進行7 d適應后進行隨機分組，一次灌胃組36只，連續灌胃組22只。

一次灌胃組：該組每只大鼠進行一次灌胃2.5×109CFU動物雙歧桿菌A12活菌細胞，選取0.17、0.5、1、2、3、6、9、12、18、24、36和48 h進行處死，3個平行，取胃、回腸、結腸和直腸4個部位的腸道內容物，與3 mL厭氧稀釋液震蕩混勻制成懸濁液。每個樣品取2份200 μL腸道內容物懸濁液，1份直接進行DNA提取，另1份經疊氮溴化丙錠處理后進行DNA提取。提取后的DNA樣品-20 ℃備用。

連續灌胃組：該組每只大鼠進行連續7 d灌胃動物雙歧桿菌A12活菌細胞2.5×109CFU。在灌胃結束后0、1、2、3、5、7、9、11、13和14 d取一部分大鼠糞便，與3 mL厭氧稀釋液震蕩混勻制成懸濁液，每個樣品取2份200 μL腸道內容物懸濁液，1份直接進行DNA提取，另1份經70 μg/mL疊氮溴化丙錠暗處理5 min，功率500 W、距樣品15 cm的光處理4 min，進行DNA提取，提取后的基因組-20 ℃備用；另一部分在灌胃結束后7 d和14 d，取盲腸和結腸2個部位的腸道內容物，與3 mL厭氧稀釋液震蕩混勻制成懸濁液，每個樣品取2份200 μL腸道內容物懸濁液，1份直接進行DNA提取，另1份經疊氮溴化丙錠處理后進行DNA提取；提取后的DNA樣品-20 ℃備用，連續灌胃后14 d結束試驗。

腸道內容物基因組DNA樣品的提取。取200 μL懸濁液，加入0.3 g直徑0.1 mm玻璃珠，300 μL Tris-SDS溶液(250 mL的200 mmol/L Tris-HCl，80 mmol/L EDTA緩沖液；pH 9.0，50 mL 10% SDS，混勻)，500 μL Tris飽和酚，上下顛倒混勻；使用球磨機劇烈震蕩30 s破碎菌細胞，16 000 r/min 4 ℃離心5 min；吸取400 μL上清于2 mL新離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)；輕輕混勻后16 000 r/min 4 ℃離心5 min；吸取300 μL上清于新的1.5 mL離心管中，加入30 μL濃度為3 mol/L乙酸鈉(pH值5.2)溶液和360 μL異丙醇，輕輕混勻后16 000 r/min 4 ℃離心5 min；棄去上清，加入70%乙醇500 μL，16 000 r/min 4 ℃離心5 min；棄去上清，溫室干燥30 min；加入pH值8.0的100 μL TE，5 μL RNase，混勻后37 ℃放置10 min，提取后的腸道內容物DNA樣品-20 ℃備用。

腸道中動物雙歧桿菌A12活菌細胞、總菌細胞定量檢測。將凍存備用的DNA樣品，進行定量PCR檢測，重復3次。正向引物CGCTCAAGCACTGCAATCAC，反向引物GATTGCTCGG GCGATTTGTG，引物20 bp；引物Tm值：正向引物57.5 ℃，反向引物57.6 ℃，GC含量為55%，擴增片段大小為197 bp。定量PCR反應體系20 μL：DNA模板1 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，TB Green?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus，貨號RR820A，TAKARA)10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，ddH2O 6.6 μL。定量PCR的反應程序：預變熱反應95 ℃，5 min；循環反應95 ℃，30 s；57.6 ℃，20 s；72 ℃，20 s；40個循環。保守延伸反應72 ℃，3 min。

1.3.2 菌株緩解便秘效果研究的分組處理方法 小鼠隨機分為4組：對照組、模型組、活菌細胞組、死菌細胞組，各個組分成2個平行小組，每小組包括小鼠6只，共計48只，小鼠進行適應性飼養7 d。

對照組和模型組每只小鼠每天灌胃生理鹽水1 mL，活菌細胞組每只小鼠每天灌胃動物雙歧桿菌A12活菌細胞2.5×109CFU，死菌細胞組每只小鼠每天灌胃動物雙歧桿菌A12死菌細胞2.5×109個。

1.3.3 小鼠排便試驗 灌胃動物雙歧桿菌A12的小鼠7 d后，各組小鼠禁吃飼料但不禁水16 h。模型組、活菌細胞組、死菌細胞組小鼠灌胃10 mg/kg復方地芬諾酯懸液(常州康普藥業有限公司)，對照組灌胃蒸餾水。

給予藥物復方地芬諾酯0.5 h后，對照組和模型組每只小鼠灌胃0.1 mL的墨汁(100 g的阿拉伯樹膠，加入800 mL的蒸餾水，煮沸，待溶液透明后加入50 g活性炭粉，煮沸2～3次，冷卻后定容到1 000 mL，放在4 ℃冰箱中保存，用前搖勻[8-9])，動物雙歧桿菌A12菌細胞懸液與墨汁等體積混合，活菌細胞組、死菌細胞組的每只小鼠灌胃含動物雙歧桿菌A12的墨汁0.1 mL，重新開始正常飲水進食。

從給小鼠灌胃墨汁開始，立即將它們轉移到新的代謝籠中，以模型組最后一只小鼠的排出首粒黑便的時間為終止，記錄各組每只小鼠的排出首粒黑便時間。并記錄5 h內的排黑便粒數、黑便質量。收集的糞便要立即進行含水量的測定，105 ℃烘干5 h至質量恒定，按照(1)式測定糞便的含水率[10]。

糞便含水率(%)=[1-(烘干后的質量/烘干前的質量)]×100%

(1)

1.3.4 小腸推進試驗 小腸有3種運動方式：蠕動、張力收縮運動和分節運動，以蠕動方式推動腸內容物移動為主要方式。灌胃復方地芬諾酯，建立小鼠小腸蠕動的抑制模型后，再用墨汁為標記物，觀察動物雙歧桿菌A12對便秘小鼠腸道蠕動的影響，做小腸推進試驗。

灌胃動物雙歧桿菌A12的小鼠14 d后，各組小鼠禁飼料但不禁水16 h。模型組、活菌細胞組、死菌細胞組小鼠灌胃10 mg/kg復方地芬諾酯懸液，對照組灌胃蒸餾水。

給復方地芬諾酯30 min后，對照組和模型組小鼠灌胃墨汁0.1 mL/kg；動物雙歧桿菌A12菌懸液與墨汁等體積混合，活菌細胞組、死菌細胞組的小鼠灌胃含動物雙歧桿菌A12的墨汁0.1 mL/kg。25 min后利用脫頸椎法使小鼠死亡，解剖腹腔分離出腸系膜，取從幽門到回盲部的腸管，將小腸拉成直線，平鋪在刻度尺上即為腸管總長度(cm)，從幽門開始量至墨汁推進前沿為墨汁推進長度(cm)，記錄每個小鼠的數據并計算墨汁推進距離占小腸總長的百分比，即為墨汁推進率，按式(2)計算[11]。

墨汁推進率(%)=(墨汁推進長度/小腸總長度)×100%

(2)

2 結 果

2.1 一次灌胃組動物雙歧桿菌A12的胃腸道分布情況

采用不同時間點對大鼠進行處死處理，提取其胃、回腸、結腸、直腸4個胃腸道部位腸道內容物的DNA，結合定量PCR進行菌細胞數的檢測，以時間為橫坐標，定量PCR檢測菌細胞數為縱坐標繪制分布規律曲線(圖1)。

胃中，動物雙歧桿菌A12總菌細胞數和活菌細胞數隨時間的增加而減少，0.17 h總菌細胞數和活菌細胞數達到最大值，分別為108.78個/g腸道內容物和108.48CFU/g腸道內容物，存活率達到50.1%，3 h之后活菌細胞數快速下降到檢測限以下，9 h總菌細胞數已經低于檢測限。

回腸中，動物雙歧桿菌A12菌細胞攝入10 min后即可到達，總菌細胞數及活菌細胞數均隨時間的增加呈現先上升后下降的趨勢，0.5 h時總菌細胞數和活菌細胞數達到最大值，分別為108.48個/g腸道內容物和107.18CFU/g腸道內容物，存活率約為5.0%，3 h后迅速下降，9 h時活菌細胞數低于檢測限，24 h時總菌細胞數低于檢測限。

結腸中，3 h時可以檢測到動物雙歧桿菌A12但未檢測到活菌細胞，表明菌細胞攝入后至多3 h，便可以到達結腸部位，隨后總菌細胞數和活菌細胞數均呈現先上升后下降的趨勢，6 h總菌細胞數和活菌細胞數達到最大值，分別為108.08個/g腸道內容物和107.58CFU/g腸道內容物，存活率31.6%，明顯高于回腸部分；36 h后結腸中的總菌細胞數和活菌細胞數均低于檢測限。

直腸中，3 h可以檢測到動物雙歧桿菌A12總菌細胞，但未檢測到活菌細胞，表明菌細胞攝入后至多3 h，便可以到達直腸部位，總菌細胞數及活菌細胞數呈現出先上升后下降的趨勢，但與結腸不同的是，直腸部位是在攝入菌細胞12 h后，總菌細胞數及活菌細胞數才達到最大值，分別為107.48個/g腸道內容物和106.88CFU/g腸道內容物，比結腸的峰值到來時間推遲9 h，同時表明大鼠攝入的動物雙歧桿菌A12，主要在9 h時排出體外，此時菌細胞的存活率為25.1%，但可以在體內保留36 h左右，此時菌細胞的存活率為63.1%，48 h后總菌細胞數及活菌細胞數低于檢測限。

2.2 連續灌胃組動物雙歧桿菌A12的保留與排空情況

采用通過給大鼠連續7 d灌服2.5×109CFU的動物雙歧桿菌A12菌細胞，灌服結束后收集大鼠糞便進行DNA提取，并結合定量PCR進行總菌細胞數及活菌細胞數的檢測，以時間為橫坐標，定量PCR檢測總菌細胞數對數值及活菌細胞數對數值為縱坐標繪制分布曲線，結果如圖2。

連續7 d灌服2.5×109CFU動物雙歧桿菌A12的大鼠，灌胃結束(0天)活菌細胞為106.68CFU/g腸道內容物，灌胃結束后1 d，即24 h，總菌細胞數達到107.08個/g腸道內容物，活菌細胞106.40CFU/g腸道內容物，均分別顯著高于一次灌胃結束24 h的總菌細胞數(105.75個/g腸道內容物)和活菌細胞數(105.50CFU/g腸道內容物)；灌胃結束2 d，即48 h，總菌細胞數106.02個/g腸道內容物，活菌細胞數105.32CFU/g腸道內容物，均分別顯著高于一次灌胃結束48 h的總菌細胞數和活菌細胞數(低于檢測限)。灌胃后3 d已經檢測不到活菌細胞存在，總菌細胞數105.86個/g腸道內容物，灌胃結束后第7天，總菌細胞數仍可檢出為105.51個/g腸道內容物；第9天，動物雙歧桿菌A12總菌細胞數低于檢測限，表明動物雙歧桿菌A12連續攝入7 d后，可在體內至少保留7 d。

2.3 連續灌胃組動物雙歧桿菌A12在盲腸與結腸的定殖情況

連續7 d攝入動物雙歧桿菌A12結束后，為進一步檢測其在體內定殖情況，收集灌服結束后7 d和14 d的盲腸和結腸腸道內容物進行DNA提取，結合定量PCR進行總菌細胞數及活菌細胞數的檢測，結果見表1。

表1 動物雙歧桿菌A12在大鼠盲腸與結腸中的保留

在灌胃結束后7 d，盲腸中檢測到105.98個/g腸道內容物的動物雙歧桿菌A12總菌細胞，但未檢測到活菌細胞；結腸中檢測到105.48個/g腸道內容物的動物雙歧桿菌A12總菌細胞，未檢測到活菌細胞；14 d后大鼠盲腸及結腸內均未檢測到動物雙歧桿菌A12菌細胞。

2.4 動物雙歧桿菌A12對小鼠便秘的緩解效果

為了進一步探討可以活著通過胃腸道的動物雙歧桿菌A12在腸道中發揮的作用，設計小鼠便秘模型，評價該菌株對便秘小鼠的糞便質量，排便時間即腸道蠕動功能的影響。

動物雙歧桿菌A12對便秘小鼠排便指標的影響見表2。在糞便含水率方面各組的數據并沒有太大的變化，說明動物雙歧桿菌A12在緩解大便干燥方面并沒有顯著的功效；模型組的小鼠排出首粒黑便的時間、5 h內排出黑便的顆粒數、糞便的質量等指標均與對照組比較有極顯著差異(P<0.01)，這說明便秘小鼠模型造模成功；活菌細胞組的小鼠排出首粒黑便時間、5 h內排便量、排便數目與模型組相較達到極顯著的水平(P<0.01)，而死菌細胞組對便秘小鼠排便指標的影響與模型組相較無顯著差異(P>0.05)。

表2 動物雙歧桿菌A12對便秘小鼠排便指標的影響Tab.2 Effect of B. animalis A12 on defecation index of constipated mice

模型組與對照組的墨汁推進率有極顯著差異(P<0.01)，表明小鼠造模成功；活菌細胞組與模型組的墨汁推進率之間有極顯著差異(P<0.01)，表明動物雙歧桿菌A12活菌細胞具有促進小腸蠕動和內容物的排出，緩解便秘的功效；而灌胃動物雙歧桿菌A12死菌細胞的小鼠的墨汁推進率與模型組比較無顯著差異(P>0.05)，表明動物雙歧桿菌A12的死菌細胞并無促進便秘小鼠腸道蠕動的作用(表3)。

表3 便秘小鼠的墨汁推進率Tab.3 Promoting rate of ink in mice with constipation

3 討 論

用PCR法對大鼠腸道環境中動物雙歧桿菌進行檢測，為了進一步驗證該方法所用引物特異性，在灌胃前對大鼠腸道內容物DNA進行PCR檢測，均未檢測到動物雙歧桿菌A12的特征產物條帶，說明選用的大鼠腸道內無內源性動物雙歧桿菌可檢出，表明疊氮溴化丙錠與聚合酶鏈式反應結合方法結合特異引物可用于檢測動物雙歧桿菌A12在大鼠腸道內的動態分布情況。在小腸中十二指腸和空腸中內容物極少，回腸內容物含量相對較多，便于收集樣品檢測；在大腸中，盲腸的環境極為復雜，而且研究多為檢測菌群豐度，在研究過程中不具有指導意義，結腸中的環境較適宜菌細胞的生存，因此，對結腸的研究較多[12]，菌株在此部位的分布具有較高價值；直腸是檢測菌細胞保留與排空的重要部位，也是研究菌株定殖的主要部位[12-13]；這是本研究選取胃、回腸、結腸和直腸4個部位作為研究菌株胃腸道分布規律的基礎。

羅佳和金鋒[14]及COLLADO等[15]通過給健康志愿者口服動物雙歧桿菌DN-173010，連續28 d，每天服用1.4×109CFU/mL，并利用雙歧桿菌屬特異探針結合熒光原位雜交技術每7 d對動物雙歧桿菌DN-173010菌細胞進行檢測，得出菌細胞隨著口服時間的延長而增多，從最初的108.52CFU/g濕糞便的排出量，28 d后可達1010.41CFU/g濕糞便，口服結束后28 d動物雙歧桿DN-173010的菌細胞恢復至初始水平，但是該研究并未針對動物雙歧桿菌DN-173010菌株進行特異性檢測，也未分辨該菌株的死菌細胞、活菌細胞，同時無法說明菌株在體內的保留時間。另外，喬雪微[12]的研究表明長雙歧桿菌BBMN68在被連續攝入7 d后，停止攝入的第3天就不能在大鼠的糞便中檢測到長雙歧桿菌BBMN68菌株，至于是否在體內保留，未開展研究。而本研究表明動物雙歧桿菌A12活菌細胞至少可在體內保留2 d，總菌細胞保留7 d以上。

不同種屬的雙歧桿菌主要是通過增加糞便中乙酸的含量，對于便秘均有緩解作用[10]，但這種便秘的緩解效果具有菌株特異性。乙酸是結腸發酵的主要產物。增加腸內乙酸量可導致腸道滲透壓增加，腸內容物含水量增加，從而刺激腸壁，增加腸蠕動[16]，死菌細胞不具有分泌乙酸的能力，因此本研究中的動物雙歧桿菌A12死菌細胞組對于促進腸道蠕動沒有顯著效果。本研究中，動物雙歧桿菌A12活菌細胞可以把便秘小鼠的小腸蠕動速率提高41.1%，與王琳琳[10]研究發現的動物雙歧桿菌CCFM 625可以把便秘小鼠的小腸蠕動速率提高25%相比具有菌株優勢，同時，對照組沒有顯著差異，可以保持正常水平。

每只大鼠一次灌服動物雙歧桿菌A12活菌細胞2.5×109CFU，胃的排空時間為6 h、回腸排空時間為24 h、結腸的排空時間為36 h、直腸排空時間為48 h。每只大鼠連續7 d灌服動物雙歧桿菌A12活菌細胞2.5×109CFU，動物雙歧桿菌A12活菌細胞至少可在體內保留2 d，定位在結腸和直腸，總菌細胞保留7 d以上。此外，動物雙歧桿菌A12的活菌細胞可以顯著提高小鼠的排便數量和質量，提高含水量，縮短排便時間，促進小腸蠕動，緩解其便秘表征。