基于組學的板栗栗蓬與栗殼主要成分分析

范斯然，范佳佳，劉 陽，張 卿，邢 宇，秦 嶺

(北京農學院植物科學技術學院，北京 102206)

板栗(CastaneamollissimaBl.)是殼斗科栗屬植物中四大經濟栽培物種之一。板栗富含多種維生素和礦物質，是典型的食藥同源植物[1]。板栗果實由栗蓬、栗殼和栗仁種子組成，栗仁僅占果實總質量的35%～40%[2]，利用過程中產生大量栗蓬、栗殼等廢棄物，已成為產業中亟待處理和解決的難點。

因為傳統化學手段僅能在栗蓬和栗殼中分離或鑒別幾種次生代謝物[3-4]，所以其中次生代謝物的種類了解的還不全面，造成了栗蓬、栗殼等廢棄物利用還僅限于粗提取或僅單一產物純化提取的現狀[5-8]。吳云龍等[9]從板栗栗蓬中分離出2種化合物。趙德義等[10]發現栗殼中的次生代謝物包括酚類、黃酮等6類。隨著組學技術的相繼發展，使更深入研究板栗果實次生代謝物的組成成為可能[11]。

本研究以花后成熟板栗栗蓬和栗殼2種組織為研究材料，利用次生代謝組學方法，分析板栗栗蓬和栗殼的次生代謝物種類及其差異，挖掘其有利用價值的次生代謝物，為板栗加工產業廢棄物資源化利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和提取方法

以北京懷柔板栗站十五年生‘燕山紅栗’為試材，選取樹勢一致、無病蟲害，結果正常的果實共30個。采集花后96 d成熟的栗蓬(Bur，BU)和栗殼(Shell，SH)。每種樣品共3個生物學重復。樣品經冷凍干燥后取100 mg粉末，用70%甲醇水溶液溶解過夜，充分震蕩3次。10 000 g，10 min離心并吸取上清液，用0.22μm微孔濾膜過濾后存放于進樣瓶中備用。

1.2 質譜采集與分析

質譜條件參照邁維(武漢)生物技術有限公司提供的代謝組檢測質譜參數，并進行優化[12]。

1.3 質控樣本

利用樣本提取物混合制備質控樣本，在檢測分析的過程中每10個樣本插入一個質控樣本用以檢測試驗的技術重復性。

1.4 數據分析方法

采用多元統計分析，利用變量的重要性投影(variable importance in project，VIP)結合。并依靠KEGG數據庫對差異次生代謝物進行注釋和通路分類。

1.5 代謝組總成分分析方法

利用軟件Analyst 1.6.3、混樣質控QC樣本的總離子流圖本地代謝數據庫、三重四級桿和MultiaQuant軟件MRM代謝物檢測多峰圖對檢測到的次生代謝物進行定性定量分析。

1.6 不同組織內代謝組學差異分析方法

1.6.1 主成分分析 對2種組織的樣本進行主成分分析，結果見圖1。共得到5個主成分，主成分1的貢獻率為78.91%。2種組織樣本在主成分分析圖上分離趨勢明顯。

1.6.2 正交偏最小二乘判別分析 根據正交偏最小二乘判別分析模型分析次生代謝組數據，建立分析模型(圖2)。模型驗證中，原始模型的R2和Q2均大于R2’和Q2’，模型有意義，根據VIP值分析篩選其差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 板栗栗蓬和栗殼次生代謝物

通過對栗蓬和栗殼試驗樣本分析，共檢測到364種次生代謝物(表1)，其中酚酸類91種、黃酮121種、木脂素和香豆素23種、鞣質39種、生物堿24種、萜類20種、其他類的次生代謝物46種。不同質控樣本的質譜表現一致，試驗重復性良好。

表1 栗蓬和栗殼中次生代謝物種類Tab.1 Statistical table of secondary metabolites in chestnut bur and chestnut shell

2.2 次生代謝物的差異性篩選與分析

2.2.1 次生代謝物成分篩選與分析 為了分析栗蓬與栗殼次生代謝物相對含量的差異，本研究原始數據中的差異倍數進行以2為底的對數處理，這里僅列差異最大的10種次生代謝物(表2)。

表2 栗蓬和栗殼差異最大的前10種次生代謝物Tab.2 Ten secondary metabolites with the greatest difference in content between chestnut bur and chestnut shell

基于對檢測到的次生代謝物的定量與定性分析，根據差異倍數的Log2FC≥1或Log2FC≤-1，且VIP值≥1，初步篩選出組織間差異的次生代謝物133種。其中酚酸類34種、黃酮57種、鞣質26種、木脂素和香豆素7種、生物堿3種、萜類1種、其他類5種，占次生代謝物的36.54%。

2.2.2 差異次生代謝物通路分析 差異次生代謝物通路分析見圖3。根據差異次生代謝物結果，利用KEGG對通路進行富集結果分析，點所在的橫坐標Rich factor值越大，則表示差異次生代謝物在對應通路中的個數與次生代謝組中注釋到的該通路物質的個數的比值越大。P-value值越小，則表示對應通路富集越顯著。圖中的點越大，則代表富集到的差異次生代謝物個數越多。

栗蓬和栗殼差異次生代謝物通過KEGG數據庫通路富集，共查詢到26個差異次生代謝物，其中差異次生代謝物富集最多的通路是(1)黃酮類生物合成途徑：包括白楊素、柚皮素等14種成分，(2)黃酮和黃酮醇的生物合成途徑：包括金合歡素、山柰酚等14種成分，(3)花色苷生物合成途徑：包括天竺葵素 3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷等4種成分。

3 討 論

本研究采用次生代謝組學技術，以成熟板栗的栗蓬、栗殼為材料，對次生代謝物進行組學定性定量檢測與分析，從全部材料中共檢測到364種次生代謝物，差異次生代謝物133種占次生代謝物的36.54%。

栗蓬相對于栗殼的次生代謝組中，上調的成分集中在鞣質與酚酸類，典型的如鞣花酸、沒食子酸和單寧的衍生物等。而栗殼相對于栗蓬，其上調成分則集中在黃酮類物質與原花青素A1上。特別是原花青素A1為栗殼特有，差異倍數的對數高達18.08。這些次生代謝物分類與含量上的差異是栗蓬與栗殼在次生代謝組上最根本的區別。

栗蓬和栗殼次生代謝組中，各有41種和20種特有次生代謝物，二者共占次生代謝物364種的23.10%。對相關文獻進行檢索，共有14種次生代謝物有相關報道，大部分具有藥用價值[13]。其中典型的為抗氧化的山柰酚[14]和有抗癌作用的6-甲基香豆素等[15]。本研究對檢測到的板栗果實栗蓬和栗殼組織中次生代謝物進行了初步分析比較，為下一步板栗資源的加工和利用提供了參考。