BasS/BasR雙組分系統調控大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1敏感性研究

陳欣玥，金君華，張紅星，謝遠紅

(北京農學院食品科學與工程學院/食品質量與安全北京實驗室/ 農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京102206)

乳酸菌細菌素是由乳酸菌產生的一類具有抑菌活性的蛋白或多肽，近年來乳酸菌細菌素以其穩定無毒、不改變食品風味的特點常作為一種新型生物防腐劑應用于食品加工與貯藏中，且有望成為抗生素的替代品[1]。細菌素按照化學結構與分子量大小可分為四類：分子量為5 kD的羊毛硫抗生素[2]；分子量小于10 kD的小分子熱穩定肽，分為IIa、IIb、IIc這3個亞類[2]；分子量大于10 kD的熱敏感大分子蛋白[2]；復合型乳酸菌細菌素[2]。目前，在所有乳酸菌細菌素中，針對IIa類乳酸菌細菌素的研究較為深入[3]：IIa類乳酸菌細菌素是由乳酸菌代謝產生的、具有革蘭氏陽性單增李斯特菌強抑菌活性的、未修飾的小分子熱穩定肽[3-4]。IIa類細菌素對革蘭氏陰性菌的作用方式主要是與敏感菌的細胞膜相互作用，引起敏感菌細胞膜的改變，使細菌發生崩解死亡[5]。革蘭氏陰性菌對于IIa類細菌素敏感性的調控機制與作用靶點目前研究尚未定論。

雙組分系統是存在于細菌細胞內、協助細菌感知適應不同環境變化的最普遍機制之一[6]。一個典型的雙組分系統是由一個位于內膜上的傳感器激酶(組氨酸激酶)和一個細胞質中的反應調節因子組成[7-9]。大腸桿菌BasS/BasR雙組分系統是大腸桿菌中的鋅鐵感應轉錄調節劑，其中BasS(又稱PmrB)為傳感器激酶蛋白，BasR(又稱PmrA)為反應調節劑，在大腸桿菌外界環境改變時，通過磷酸化激活下游靶基因轉錄，改善細胞狀態，維持細胞穩定[10-13]。已有研究表明，BasS/BasR雙組分系統通過修飾細胞膜來增加大腸桿菌的抗藥性，如對多粘菌素B的抗性[14]。BasS/BasR雙組分系統調控大腸桿菌對植物乳桿菌素抗性的研究較少。

在前期研究中，本課題組從傳統發酵肉制品中分離鑒定得到1株植物乳桿菌BM-1。植物乳桿菌BM-1能夠代謝產生一種IIa類乳酸菌細菌素即植物乳桿菌素BM-1。該細菌素對單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌等都有一定的抑菌作用[12]。

本研究旨在篩選大腸桿菌(Escherichiacoli)中與植物乳桿菌素BM-1直接作用的大腸桿菌細胞膜上的互作蛋白，并分析其影響大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1的敏感性作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073、突變型大腸桿菌JW4074是2016年10月購于大腸桿菌突變體庫KEIO collection，詳情見表1。

表1 菌株特性及來源Tab.1 Strain features and source

植物乳桿菌BM-1產植物乳桿菌素BM-1，由北京農學院農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室保藏。

MRS肉湯，MRS瓊脂培養基，LB培養基[13]，制備培養基使用的試劑均為國產分析純級；硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、EDTA、尿素和脫氧膽酸鈉，購于國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂，購于北京奧博星生物技術有限公司；3500Da透析袋，購于北京瑞達恒輝科技發展有限公司；Bacteria RNA Extraction Kit、HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit，購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 試驗儀器

DL-CJ-1NDII超凈臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；LHS-100CH恒溫恒濕箱，上海一恒科技有限公司；DYY-6DCP-32B型恒流電泳儀，北京六一儀器廠；GL-21M臺式冷凍離心機，上海滬湘儀離心機儀器有限公司。

BT2202S電子天平(Starorius)，StepOnePlus Real-Time PCR System(ABI)，磁力架(蘇州海貍生物科技有限公司)，MiniBeadBeater-16(BioSpec)，翻轉架(北京大龍興創實驗儀器有限公司)，電導儀(Mettler)，紫外分光光度計(上海佑科儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物乳桿菌素BM-1的制備 采用pH介導細胞吸附-解吸技術與陽離子交換色譜法純化植物乳桿菌素BM-1[12]。將植物乳桿菌素BM-1培養液加熱后調節pH至pH值6.0，于室溫條件下攪拌30 min，使植物乳桿菌素BM-1吸附到細胞表面；離心收集細胞，洗滌沉淀后，使用100 mmol/L NaCl重懸，調節pH至pH值2.0，4 ℃條件下攪拌12 h，離心后上清4 ℃條件下使用ddH2O透析24 h，冷凍干燥后得到第一步純化后的植物乳桿菌素BM-1。使用檸檬酸鈉緩沖液重懸第一步純化后的植物乳桿菌素BM-1；使用SP-Sepharose快速流動陽離子交換色譜柱(長度200 mm，內徑10 mm)將重懸后的植物乳桿菌素BM-1上樣，使用pH值3.1的檸檬酸鈉緩沖液進行洗脫，直到檢測不到280 nm處吸光值；使用0.1～0.5 mol/L NaCl線性梯度洗脫植物乳桿菌素BM-1，收集活性成分，使用ddH2O透析后得到純化的植物乳桿菌素BM-1，用牛津杯測定此時細菌素效價[12]。

1.3.2 大腸桿菌與植物乳桿菌素BM-1互作蛋白的篩選 以1×102CFU/mL接種量將野生型大腸桿菌K12接種到5 mL LB培養基中，37 ℃培養至菌液OD值為0.5。菌液中加入植物乳桿菌素BM-1至最終效價為512 AU/mL，37 ℃培養2 h；以不添加植物乳桿菌素BM-1的大腸桿菌為對照。12 000 r/min將培養好的菌液離心10 min，棄上清，用1 mL PBS(pH值7.4)復溶離心后的菌液沉淀，加入0.3 g玻璃珠(100 mm)，使用Beadbeater破碎菌體2次。靜置破碎后的菌液，小心吸取上清，12 000 r/min離心上清10 min，向沉淀中加入9倍體積包涵體裂解液，室溫下靜置30 min，12 000 r/min離心5 min，使用包涵體溶解液溶解沉淀，得到菌體蛋白。取490 μL菌體蛋白溶液，加入10 μL偶聯植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體的磁珠[15]，4 ℃旋轉反應過夜。反應后磁珠用1×PBS緩沖液和0.1%脫氧膽酸鈉洗滌2次，蛋白電泳檢測洗脫液。

蛋白洗脫液使用液相色譜-串聯質譜進行蛋白鑒定：首先使用Orbitrap Fusion Lumos與Easy-nLC 1000液相色譜系統(Thermo Fisher Scientific)，用0.1%甲酸水溶液溶解標記樣品，將溶解后肽段裝載至C18反相柱(預柱填料粒徑3 μm，孔徑120?，2 cm×100 μm ID；分析柱填料粒徑1.9 μm，孔徑120?，15 cm×150 μm ID)進行預分離，流速600 nL/min，洗脫60 min；使用Lumos3質譜儀(Thermo Fisher Scientific)，采用DDA模式(data-dependent acquisition mode)進行分析。一級質譜使用Orbitrap進行全掃描，掃描范圍350～1 550 m/z，掃描分辨率120 000，AGC targets為4e5 ions，Max injection time為50 ms；二級質譜采集通過32%的高能碰撞解離(HCD)對母離子進行碎裂，碎片離子在Orbitrap中進行檢測，First Mass為100，分辨率15 000，AGC targets為5e4 ions，Max injection time為22 ms，動態排除30 s；最后采用Proteome Discoverer2.1軟件對質譜數據進行分析，得到蛋白定性和定量信息。

1.3.3 BasS/BasR雙組分系統缺失大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1的敏感性分析 取生長至對數期的野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073和突變型大腸桿菌JW4074，將這3種菌液分別接種至5 mL的LB培養基中，使其終濃度為1×102CFU/mL，加入植物乳桿菌素BM-1，使其效價為512 AU/mL；以不添加植物乳桿菌素BM-1的野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073和突變型大腸桿菌JW4074為對照。37 ℃培養24 h，每隔2 h進行1次菌落計數，最終繪制出植物乳桿菌素BM-1作用下3株大腸桿菌的活菌數曲線[16]。

1.3.4 植物乳桿菌素BM-1對缺失BasS/BasR雙組分系統大腸桿菌電導率的檢測 將接種量是1×102CFU/mL的野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073、突變型大腸桿菌JW4074分別接種到5 mL培養基中，并加入植物乳桿菌素BM-1使其最終效價為512 AU/mL，37 ℃培養14 h，每隔2 h測1次電導率；以不加植物乳桿菌素BM-1的野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073、突變型大腸桿菌JW4074為對照。

1.3.5 BasS/BasR雙組分系統缺失對大腸桿菌基因表達的檢測 將接種量是1×102CFU/mL的野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073、突變型大腸桿菌JW4074分別接種到5 mL培養基中，37 ℃培養12 h。提取細菌總RNA進行實時熒光定量PCR反應。反應條件為50 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40次循環，使用引物如表2所示。將野生型大腸桿菌K12作為內參因子，使用2-△△Ct法計算突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074中各個基因的相對表達量。

表2 引物序列Tab.2 Sequence of primers

1.3.6 數據處理與分析 試驗至少重復3次，數據以平均值±標準偏差表示，并對數據進行方差分析(ANOVA)。使用Origin 2019程序繪制圖表。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 大腸桿菌與植物乳桿菌素BM-1互作蛋白的篩選

植物乳桿菌素BM-1單克隆抗體進行免疫共沉淀后洗脫蛋白電泳如圖1所示。第1泳道內經植物乳桿菌素BM-1處理后的大腸桿菌在20 kD處出現明顯條帶，第2泳道的大腸桿菌同樣在20 kD處出現較暗的背景蛋白條帶。經蛋白質譜對比去除大腸桿菌的背景蛋白后，篩選得到一個豐度指標0.233，分子量為25.015 kD，含有222個氨基酸且可信度高的大腸桿菌菌體蛋白，質譜鑒定其為大腸桿菌DNA結合轉錄雙調節因子BasR(P30843)。

2.2 BasS/BasR雙組分系統缺失大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1的敏感性影響

使用活菌計數法進一步分析BasR蛋白所在BasS/BasR雙組分蛋白基因突變對大腸桿菌植物乳桿菌素BM-1敏感性的影響，結果如圖2所示。野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074這3株大腸桿菌在不添加植物乳桿菌素BM-1單獨培養時，均呈現典型的生長規律。野生型大腸桿菌K12在單獨培養6 h時，活菌數呈現上升趨勢，進入指數增長期，并在12 h達到穩定期，此時活菌數為9.38 lgCFU/mL，此后24 h內活菌數呈現穩定狀態。突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074在不添加植物乳桿菌素BM-1時，生長趨勢總體與野生型大腸桿菌K12相似，但進入指數期較野生型大腸桿菌K12更為提前，4 h活菌數呈現上升趨勢，進入指數增長期，且在指數增長期增長速度更快。在此之后的8 h和10 h處突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074的活菌數達到穩定期，最終活菌數分別為7.24 lgCFU/mL和7.27 lgCFU/mL。

添加植物乳桿菌素BM-1培養后，野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074這3株大腸桿菌活菌數在24 h內的變化趨勢與單獨培養相比產生明顯變化。添加植物乳桿菌素BM-1后，野生型大腸桿菌K12在前14 h培養時間內活菌數增加明顯被抑制，未出現變化，第16小時活菌數呈現上升趨勢，進入指數期，第24小時活菌數達到6.33 lgCFU/mL。相比之下，添加植物乳桿菌素BM-1培養后，突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074的生長在前14 h被抑制，第16小時活菌數進入指數增長期，但增長速度較同時期相同培養條件的野生型大腸桿菌K12更為緩慢，且相對于單獨培養時，添加植物乳桿菌素BM-1后突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074這2株突變型大腸桿菌的指數增長期被延后，到達指數期的時間與添加植物乳桿菌BM-1培養的野生型大腸桿菌K12相同。第24小時突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074的活菌數分別為4.67 lgCFU/mL與4.91 lgCFU/mL，顯著低于野生型大腸桿菌K12第24小時的活菌數。說明植物乳桿菌素BM-1對突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074的生長造成的影響更大，即相對于野生型大腸桿菌K12，BasS/BasR雙組分系統缺失的突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074對植物乳桿菌素BM-1更敏感。

2.3 植物乳桿菌素BM-1對缺失BasS/BasR雙組分系統大腸桿菌電導率的影響

野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073與突變型大腸桿菌JW4074這3株大腸桿菌在添加與不添加植物乳桿菌素BM-1條件下培養的電導率在14 h內均呈現緩慢上升趨勢，但添加植物乳桿菌素BM-1培養的大腸桿菌與單獨培養的大腸桿菌的電導率變化趨勢相似，差異均不顯著，未產生明顯對比(P>0.05)，見圖3。雖然這3株大腸桿菌均對植物乳桿菌素BM-1表現出不同程度的敏感性，但植物乳桿菌素BM-1的添加并未造成大腸桿菌細胞膜的破裂和內容物外泄。

2.4 BasS/BasR雙組分系統缺失對大腸桿菌基因表達的影響

提取野生型大腸桿菌K12、突變型大腸桿菌JW4073、突變型大腸桿菌JW4074的總RNA(圖4)，實時熒光定量PCR檢測結果如圖5所示。突變型大腸桿菌JW4073的dgka基因與野生型大腸桿菌K12相比顯著下調了71%，mlaf基因下調了37%。突變型大腸桿菌JW4074與野生型大腸桿菌K12相比，dgka基因顯著下調了93%，mlaf基因顯著下調了71%，eco基因顯著下調了95%。在不表達BasS/BasR雙組分系統后，突變型大腸桿菌中細胞膜結構與功能相關蛋白表達被降低。

3 討 論

細菌素來源廣泛，種類繁多，且低毒性與不易產生耐藥性的特點引起人們廣泛關注，但目前針對IIa類細菌素對革蘭氏陰性菌的抑菌機理以及作用靶點研究還不夠深入[17-18]。本試驗通過免疫共沉淀篩選得到與IIa類細菌素植物乳桿菌素BM-1產生作用的大腸桿菌菌體蛋白BasR，其屬于BasS/BasR雙組分系統，該雙組分系統的基因突變導致大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1敏感性加強，證明BasS/BasR雙組分系統能夠調控大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1的敏感性。

以往的研究表明，對于革蘭氏陰性菌，IIa類細菌素對其作用方式是通過與菌體細胞表面產生靜電作用從而使細菌素吸附在細胞膜表面，穿過脂多糖，進入細胞質膜，造成孔洞，從而破碎菌體細胞，使內容物外泄，達到殺菌作用[19-20]。本研究中電導率結果顯示大腸桿菌細胞膜并未破裂，說明植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的作用方式與已有的IIa類細菌素對革蘭氏陰性菌的作用方式不同，即添加植物乳桿菌素BM-1后，大腸桿菌細胞膜并未破裂。結合大腸桿菌生長曲線結果，推斷植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的作用方式為抑制細菌生長而不是通過破碎細胞導致菌體死亡。

本研究中發現BasS/BasR雙組分系統參與大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1敏感性調控。BasS/BasR雙組分系統感應到外界環境變化被激活后，參與細胞膜結構、膜轉運與結合的基因會被該雙組分系統明顯上調，使菌體在不利環境下依然保持穩定[21]。大腸桿菌BasS/BasR雙組分系統的調控機制與沙門氏菌中PmrA/PmrB雙組分系統相類似[22]，組氨酸蛋白激酶BasS感知到細菌外界環境變化后，由HATPase結構域供能，BasS蛋白hisKA結構域的組氨酸被磷酸化，將信號傳遞給反應調節因子BasR蛋白，從而激活下游靶基因轉錄[23-24]。相關研究表明，腸桿菌科細菌BasS/BasR雙組分系統可通過誘導下游靶基因轉錄的方式，修飾脂質A，參與細胞膜磷脂雙分子層的修飾，來達到抵抗多粘菌素B的作用[25]。BasS/BasR雙組分系統調控下游靶基因，包括參與膜結構形成與修飾的dgka、調節膜功能的mlaf、參與細胞應激反應功能的eco等，這些基因的表達均可以穩定細胞膜形態[24]。相關試驗已經證實在添加植物乳桿菌素BM-1的條件下，野生型大腸桿菌K12可通過加速肽聚糖合成，調節細胞膜表達，維持細胞超微結構的方式來抵御來自細菌素的傷害[26]。本試驗結合已有研究結果，將大腸桿菌BasS/BasR雙組分系統與大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1抗性相關聯，通過RT-qPCR驗證大腸桿菌中BasS/BasR雙組分系統蛋白基因突變，Dgka、MlaF、Eco這3個蛋白編碼基因的轉錄表達水平顯著變化，證明該雙組分系統的缺失確實降低大腸桿菌中dgka，mlaf和eco等基因轉錄水平的表達，從而弱化大腸桿菌細胞膜強度，降低大腸桿菌細胞膜剛性，提高大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1的敏感性。

植物乳桿菌素BM-1針對野生型大腸桿菌K12的作用體現在抑制細菌生長，并非導致菌體破裂死亡，而大腸桿菌BasS/BasR雙組分系統的缺失會導致大腸桿菌對植物乳桿菌素BM-1敏感性提高，從而有效增強植物乳桿菌素BM-1對大腸桿菌的抑制效果。