植物乳桿菌SD26的篩選及對白色念珠菌的抑菌作用

喬榮更，張紅星，謝遠紅，金君華，劉 慧

(北京農學院食品科學與工程學院/食品質量與安全北京實驗室，北京 102206)

白色念珠菌(Candidaalbicans)是口腔中最常見的致病性真菌，當局部微環(huán)境改變或者口腔菌群失衡時，白色念珠菌就會轉變?yōu)橹虏【痧つつ钪榫』蛳到y(tǒng)性念珠菌病[1]。若治療不及時，會有癌變的風險，而目前主要采用的抗生素療法不僅會破壞口腔菌群的正常生態(tài)，還會導致耐藥性問題，因此選擇安全有效的治療手段具有重要的意義[2]。

在自然界中，乳酸菌廣泛存在各種發(fā)酵食品中，尤其是泡菜，是一種公認的益生菌[3]。乳酸菌作為活的微生物，當在人體中達到一定數(shù)量時，會對人體健康有益[4]。據(jù)報道，有學者研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌和白色念珠菌共培養(yǎng)后能有效抑制白色念珠菌的生長[5]。本研究旨在為應用益生菌防治口腔白色念珠菌提供基礎，為后續(xù)在中國生產研發(fā)相關產品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1 材 料 白色念珠菌(Candidaalbicans) ATCC10231：購自美國典型菌種保藏中心，所用培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基；泡菜樣品采樣自四川大涼山農家泡菜，所用培養(yǎng)基為乳酸細菌培養(yǎng)基。現(xiàn)均保存于北京農學院食品質量與安全北京實驗室-81 ℃菌庫中。

乳酸細菌培養(yǎng)基制備參見文獻[6]。酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基：2 g胰蛋白胨、1 g酵母浸粉、2 g葡萄糖，溶于100 mL去離子水，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，其固體培養(yǎng)基每100 mL含1.5 g瓊脂粉。

1.1.2 儀 器 細菌基因DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。0.22 μm無菌過濾器，Merck MiLLipore公司；牛津杯(內徑6.5 mm，外徑8.0 mm)，北京先驅威鋒技術開發(fā)公司。DL-CJ-1N超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司；pHS-3B便攜式酸度計，上海雷磁儀器廠；游標卡尺，杭州易宏制造有限公司。

BIOFUGE STRATOS臺式冷凍離心機、Thermo Scientific；PTC-200型PCR儀，BIO-RAD公司；掃描電鏡SU8100、透射電鏡HT7800(80KV)，日立高新技術公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的篩選 采用涂布平板法[7]：稱取5 g泡菜樣品放入無菌均質袋中，加入45 mL無菌生理鹽水拍打混勻后，梯度稀釋，分別吸取稀釋倍數(shù)為10-3、10-4、10-5、10-6的泡菜樣品100 μL，涂布于含2.5% CaCO3的乳酸細菌培養(yǎng)基平板上，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。挑取長勢良好，溶鈣圈明顯的菌落，通過平板劃線法反復分離純化，菌株編號為SD26，甘油保藏于-80 ℃冰箱。

1.2.2 乳酸菌的鑒定 將菌株SD26進行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗，并對其生理生化指標進行測定。試驗結果對照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》進行菌種的初步判定[8]。

根據(jù)細菌基因DNA提取試劑盒說明操作提取菌株SD26基因DNA，以基因DNA為模板進行16S RNA基因的PCR擴增。擴增引物使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。其中PCR反應體系：DNA 1 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。然后將PCR擴增產物送去DNA測序(上海生工生物工程有限公司)。測序序列結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中用Blast軟件搜索近似序列，將所測得的序列和從基因庫中獲得的相關種屬的16S RNA基因序列進行比對。

1.2.3 抑菌活性測定 采用牛津杯法[9]，取100 μL活菌數(shù)為107CFU/mL的白色念珠菌于平板內，倒入適量加熱熔化的酵母浸出粉胨葡萄糖固體培養(yǎng)基，搖晃均勻，待其冷卻凝固后，在平板內適當?shù)拈g隔依次放入牛津杯，然后取菌株SD26上清液100 μL添加至牛津杯孔內，并用等量的乳酸細菌液體培養(yǎng)基做陰性對照；質量濃度為20 mg/mL的抗真菌藥物咪康唑、氟康唑和克霉唑做陽性對照。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑，3個重復。

1.2.4 白色念珠菌生長曲線的測定 白色念珠菌生長曲線的測定分為2組。取活菌數(shù)為107CFU/mL的白色念珠菌100 μL接種于5 mL酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，震蕩均勻。試驗組添加菌株SD26上清液5 mL，對照組不添加菌株SD26上清液。置于37 ℃搖床180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔0、4、8、12、16、20和24 h取樣，測定其OD600 nm，3個重復，繪制白色念珠菌的生長曲線。

1.2.5 白色念珠菌最小抑菌活菌數(shù)的測定 參照郭夏蕾等[10]的研究方法，并進行改進，將菌株SD26上清液，調到3.2×109CFU/mL，然后2倍稀釋至菌液濃度1.6×109、8.0×108、4.0×108、2.0×108CFU/mL，用牛津杯法對活菌數(shù)為3.0×107CFU/mL的白色念珠菌做抑菌試驗。其中，最小抑菌活菌數(shù)以有抑菌圈的最小活菌數(shù)值為準。

1.2.6 菌株SD26上清液對白色念珠菌細胞形態(tài)的影響 取生長至對數(shù)期的白色念珠菌菌液，分為2組，以1×104CFU/mL的接種量接到5 mL酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中振蕩均勻。試驗組向其中加入菌株SD26上清液5 mL，搖勻。對照組不加菌株SD26上清液。放入37 ℃搖床180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。于4 ℃，1000×g離心10 min，棄上清，將離心管里的沉淀轉移到1.5 mL的離心管內，沿管壁緩緩加入1 mL新預冷的2.5%戊二醛，置于4 ℃冰箱固定后掃描電鏡掃描菌體表面結構和透射電鏡觀察白色念珠菌的細胞形態(tài)與內部構造。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，數(shù)值均用平均值±標準差表示，采用Duncan多重比較檢驗，以P<0.05表示差異顯著。采用Origin8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析作圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

從泡菜樣品中成功篩選分離出1株乳酸菌，稀釋倍數(shù)為10-4時其溶鈣圈見圖1，平板劃線菌落形態(tài)見圖2。

2.2 乳酸菌的鑒定

該篩選菌株革蘭氏染色為紫色，呈陽性。其細胞形狀為桿狀，接觸酶和氧化酶為陰性，無芽孢形成。其理化試驗結果見表1，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。根據(jù)該菌種的細胞形態(tài)、生理生化特征、16S RNA基因序列等數(shù)據(jù)綜合分析，參考《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》，鑒定結果為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)SD26。

表1 篩選菌株的理化試驗Tab.1 Physical and chemical tests for screening strains

2.3 抑菌活性測定結果

由牛津杯法測得菌株SD26及抗真菌藥物咪康唑、氟康唑和克霉唑對白色念珠菌的抑菌活性見圖4。菌株SD26對白色念珠菌的抑菌活性最大，抑菌圈直徑大于25 mm。而在相同質量濃度20 mg/mL下，抗真菌藥物克霉唑對白色念珠菌的抑菌圈直徑明顯大于咪康唑和氟康唑，但均與菌株SD26的抑菌圈直徑存在顯著差異(P<0.05)。

2.4 白色念珠菌生長曲線的測定結果

對照組無菌株SD26上清液作用的白色念珠菌在24 h內其OD600 nm呈逐漸上升趨勢；而試驗組經菌株SD26上清液作用的白色念珠菌在24 h內其OD600 nm均趨于零水平。由此表明植物乳桿菌菌株SD26上清液能顯著抑制白色念珠菌的生長(圖5)。

2.5 白色念珠菌最小抑菌活菌數(shù)的測定結果

植物乳桿菌SD26對白色念珠菌的最小抑菌活菌數(shù)可以在某種程度上反映白色念珠菌對植物乳桿菌的敏感性，同時也能反映植物乳桿菌對白色念珠菌的抑菌效果。植物乳桿菌SD26對活菌數(shù)為3.0×107CFU/mL的白色念珠菌的最小抑菌活菌數(shù)為4.0×108CFU/mL (表2)。

表2 植物乳桿菌菌株SD26對白色念珠菌的最小抑菌活菌數(shù)Tab.2 The minimum inhibitory viable number of SD26 against Candida albicans

2.6 菌株SD26上清液對白色念珠菌細胞形態(tài)的影響

菌株SD26上清液對白色念珠菌細胞形態(tài)的影響如圖6所示。經掃描電鏡對白色念珠菌菌體表面觀察發(fā)現(xiàn)，試驗組和對照組中白色念珠菌菌體表面有明顯的差異性。對照組正常生長狀態(tài)的白色念珠菌菌體表面光滑、無褶皺、無破損現(xiàn)象；而試驗組經菌株SD26上清液處理24 h后的白色念珠菌菌體大部分細胞表面變得粗糙、凹凸不平、扭曲變形，甚至有黏絲狀物質出現(xiàn)，菌體表面有褶皺并伴隨空洞現(xiàn)象。

經透射電鏡對白色念珠菌菌體細胞結構觀察發(fā)現(xiàn)，對照組正常生長的白色念珠菌菌體細胞膜與細胞壁結構完整、均一，胞漿均勻，致密；而試驗組經菌株SD26上清液處理24 h后的白色念珠菌菌體細胞膜破損，細胞壁變薄，細胞內部胞質分散，出現(xiàn)空洞，導致內容物流出致死。

綜上，植物乳桿菌SD26對白色念珠菌在細胞水平上有破壞作用。

3 討 論

近年來，因白色念珠菌導致的口腔真菌感染率在不斷增加，而目前主要采用的抗真菌藥物普遍存在抗菌譜窄、不良反應強、生物利用度差和易產生耐藥性等缺點，因此尋找安全、高效和不易產生耐藥性的抗真菌替代方法已成為目前研究的熱點[11]。而采用益生菌乳桿菌干預口腔致病菌的方法，即可以改善口腔微生態(tài)環(huán)境，又可以讓有益菌成為優(yōu)勢菌維持口腔健康。

在泡菜中廣泛存在乳酸菌且具有食品安全性，因而人們常常從泡菜中篩選分離乳酸菌菌株。杜曉華等[12]從四川發(fā)酵泡菜中篩選得到1株植物乳桿菌；周光燕[13]從發(fā)酵泡菜汁樣品中分離得到8株植物乳桿菌；陳靜等[14]從泡菜中分離得到4株乳酸桿菌。而本研究從四川大涼山農家泡菜中成功篩選分離出1株乳酸菌，經相關鑒定該菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) SD26。有研究表明，乳酸菌在生長代謝中能產生有機酸、細菌素、過氧化氫等物質，抑制口腔致病菌的生長繁殖，從而保護口腔健康[15]。本研究中植物乳桿菌菌株SD26對白色念珠菌的抑菌圈直徑可達26 mm，顯著大于抗真菌藥物咪康唑、氟康唑和克霉唑，證實了乳酸菌菌株生長代謝產生的物質對口腔致病菌的抑制作用。秦蘇佳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌CCFM8724與致齲雙菌變異鏈球菌和白色念珠菌共培養(yǎng)后，白色念珠菌的生物膜結構明顯變得松散，對其生物膜結構造成十分顯著的破壞。而本研究是將植物乳桿菌SD26與白色念珠菌共培養(yǎng)測定其OD值，與對照組相比，試驗組白色念珠菌的OD600 nm值在24 h趨于零水平，表明植物乳桿菌SD26對白色念珠菌的生長有破壞。王楊等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)，當白色念珠菌細胞膜受到破壞和損傷時，會增加其菌體細胞膜的通透性，導致其細胞內[K+]、[Ca2+]等離子流失和DNA、RNA等大分子的泄漏，最終引起菌體死亡。本研究通過電鏡試驗觀察到經植物乳桿菌SD26作用后的白色念珠菌菌體表面出現(xiàn)凹陷，菌體出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，細胞壁殘缺，細胞上出現(xiàn)破洞現(xiàn)象。推測植物乳桿菌SD26對白色念珠菌的抑菌機制是破壞菌體細胞膜的完整性。

本研究從四川大涼山農家泡菜中成功篩選分離出1株乳酸菌，經相關研究鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) SD26。將該植物乳桿菌SD26對口腔白色念珠菌進行抑菌研究，初步發(fā)現(xiàn)其抑菌機理可能是破壞了白色念珠菌細胞膜的完整性。