7批北蒼術樣品藥效組分的高效液相色譜測定

文 君，趙雅芬，馮瑩瑩，田曄林，王建舫*

(1. 北京農學院獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室/動物類國家級實驗教學示范中心， 北京 102206；2. 北京農學院園林學院，北京 102206)

蒼術為菊科植物茅蒼術(Atractylodeslancea(Thunb.) DC.)或北蒼術(Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.)的干燥根莖。春季和秋季采挖，除去泥沙，曬干，撞去須根。具有燥濕健脾，祛風散寒，明目之功效。用于濕阻中焦，脘腹脹滿，泄瀉，水腫，腳氣痿蹵，風濕痹痛，風寒感冒，夜盲，眼目昏澀[1]。目前，對蒼術化學成分的定量分析方法主要有氣相色譜(Gas Chromatography，GC)和高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)等[2]。對于同時定量檢測蒼術中蒼術素、蒼術酮和β-桉葉醇分析方法主要是GC法，HPLC法和其他方法文獻報道較少。目前研究人員利用GC法分別建立同時檢測蒼術素、蒼術酮和β-桉葉醇含量的方法[2-9]。此外，曹琰等[10]、歐陽臻等[11]、曾志等[12]用氣相色譜儀串聯質譜檢測器建立同時測定β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮含量的方法。為了進一步提高檢測靈敏性，陸奇杰等[13]、李琴瑜等[14]、孫金等[15]用HPLC法分別建立同時檢測蒼術素、蒼術酮、β-桉葉醇含量的方法，建立的檢測方法雖然在檢測靈敏度具有一定的優勢，但卻存在出峰時間過長或需要多波長檢測等不足。為了建立一種檢測方法簡單、易于操作和靈敏度較高的方法，本研究探討利用HPLC檢測北蒼術中β-桉葉醇、蒼術酮和蒼術素含量，建立用同一波長檢測北蒼術中這3種成分的方法，為中國傳統中藥成分的提取和檢測提供幫助。

1 材料與方法

1.1 儀器與試驗材料

高效液相色譜儀(Waters e2695)，二極管陣列檢測器(Waters 2998)，Empower2軟件(Waters公司)；電子天平(AL104，梅特勒公司)；數碼超聲波清洗器(KQ5200DV，昆山市超聲儀器有限公司)；防腐隔膜真空泵(GM 0.33 A，天津市津騰實驗設備有限公司)；溶劑過濾器(1 L，天津市津騰實驗設備有限公司)。

β-桉葉醇對照品，批號：190612；蒼術素對照品，批號：19072205；蒼術酮對照品，批號：18110201；均購自成都普菲德生物技術有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，均購自賽默飛世爾科技有限公司。7批次北蒼術樣品經北京農學院園林學院田曄林鑒定為北蒼術，信息見表1。

表1 北蒼術樣品信息Tab.1 Sample information of Atractylodis Rhizoma

1.2 色譜條件

色譜柱YMC-Pack ODS-A (150 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈 58.5，0～20 min；58.5～85，20～60 min；10%甲醇41.5，0～20 min；41.5～15，20～60 min。檢測波長200 nm。流速1.0 mL/min。柱溫26 ℃。

1.3 溶液的配制

1.3.1 混合對照品溶液的配制 精密稱取10 mg β-桉葉醇對照品，放入10 mL錐形瓶，加入10 mL甲醇，定容，混勻，命名為溶液1。精密稱取蒼術素對照品5 mg，蒼術酮對照品5 mg放入5 mL錐形瓶，加入5 mL溶液1，定容，混勻。此時，甲醇溶液中β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的質量濃度均為1 mg/mL，命名為混合對照品溶液A；精密量取1 mg/mL混合對照品溶液A 2.5 mL加入到5 mL錐形瓶，加入2.5 mL甲醇，混勻，此時混合對照品溶液的質量濃度均為0.5 mg/mL；精密量取0.5 mg/mL的混合對照品溶液2.5 mL加入到5 mL錐形瓶，加入2.5 mL甲醇，混勻，此時混合對照品溶液的質量濃度均為0.25 mg/mL；依次類推，直至進行到8個倍比稀釋。加上混合對照品溶液A,得到9個質量濃度梯度的混合對照品溶液B，質量濃度分別為1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、0.0625、0.0313、0.0157、0.0079、0.0040 mg/mL。

精密吸取4 mL溶液1，加入4 mL甲醇，混勻；從中吸取5 mL，加入3 mL甲醇，混勻，命名為溶液2。精密稱取蒼術素對照品5 mg，加入10 mL甲醇，混勻；從中吸取5 mL，加入5 mL甲醇，混勻，命名為溶液3。精密稱取蒼術酮對照品5 mg，加入10 mL甲醇，混勻；從中吸取5 mL，加入3 mL甲醇，混勻，命名為溶液4。精密量取5 mL溶液2，2.5 mL溶液3，2.5 mL溶液4，配制成混合對照品溶液C。

1.3.2 北蒼術樣品溶液的配制 取北蒼術樣品粉末，過3號篩(孔徑270 μm)，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)，40 ℃，1 h，放冷，再稱定，用甲醇補足損失的質量，搖勻，用孔徑74 μm濾網過濾，即得[1]。

1.4 方法學考察

1.4.1 專屬性測定 分別精密吸取0.1250 mg/mL的混合對照品溶液和北蒼術樣品溶液10 μL進樣，用Empower2軟件計算混合對照品和北蒼術樣品中β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的保留時間，北蒼術樣品的分離度和理論塔板數，導出混合對照品和北蒼術樣品的色譜圖。

1.4.2 線性關系測定 分別取9個質量濃度梯度的混合對照品溶液B 2 mL，用0.22 μm有機濾膜過濾到進樣瓶中，自動取10 μL進樣，用Empower2計算峰面積。以混合對照品(mg/mL)為橫坐標，以峰面積(μv×s)為縱坐標，用Excel 2016軟件做出混合對照品線性關系圖。

1.4.3 精密度、重復性和穩定性的測定 精密吸取0.1250 mg/mL的混合對照品溶液10 μL，用“1.2”的色譜條件，連續進樣6次，用Empower2軟件計算峰面積，用Excel 2016軟件計算相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)，進行精密度的測定。精密吸取北蒼術樣品溶液，連續進樣6次，每次10 μL，計算峰面積和RSD，進行重復性的測定。設置程序分別在0、2、4、6、8、24 h進樣，每次10 μL，計算峰面積和RSD，進行穩定性的測定。

1.4.4 加樣回收的測定 分別稱取0.25 g北蒼術樣品粉末，按照“1.3.2”的方法制備6個北蒼術樣品溶液，各精密吸取1 mL，分別加入1 mL混合對照品溶液C，混勻，此為6個加樣回收溶液。分別精密吸取10 μL混合對照品C、6個北蒼術樣品溶液和6個加樣回收溶液，注入高效液相色譜儀，分別測定，計算各成分的含量。按照2020版《中國藥典》關于回收率的計算方法進行計算。

1.5 北蒼術樣品含量測定

分別精密稱取北蒼術樣品0.25～0.3 g，制備方法按“1.3.2”進行，色譜條件按“1.2”進行測定，用Empower2軟件計算峰面積，然后以外標法計算北蒼術樣品中β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮含量。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性試驗 北蒼術樣品中β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的保留時間與相應的對照品基本一致，且β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮與前后峰的分離度均大于2020版《中國藥典》規定的1.5；北蒼術樣品中β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的理論塔板數分別為16284、14939和49778(圖1)。

2.1.2 線性關系試驗 混合對照品線性關系見圖2。β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的線性方程分別為y=2E+07x+39661，y=8E+07x+316345，y=2E+07x+17758；R2分別為0.9998、0.9992和0.9999。

2.1.3 精密度、重復性和穩定性試驗 精密吸取0.1250 mg/mL的混合對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的RSD分別為0.24%、0.23%、0.20%，表明精密度良好。

精密吸取北蒼術樣品溶液，連續進樣6次，每次10 μL，β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的RSD分別為1.50%、1.38%、0.85%，表明重復性良好。

分別在24 h的不同時間內精密吸取北蒼術樣品溶液6次，每次10 μL，β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的RSD分別為0.98%、1.32%、1.11%，表明北蒼術樣品在24 h基本穩定。

2.1.4 加樣回收試驗 加樣回收結果見表2。β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮平均回收率分別為99.07%、100.18%和100.81%，RSD分別為1.17%、0.73%和1.36%。β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮平均回收率符合2020版《中國藥典》規定的92%～105%的標準，表明回收合格。

表2 加樣回收結果Tab.2 Sample recovery rate

2.2 北蒼術樣品含量測定

7批北蒼術樣品，每批3個重復，用高效液相色譜儀進行測定，北蒼術中β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮含量見表3。陜西商洛的β-桉葉醇含量最高，為30.9835 mg/g，內蒙古2的含量最低，為3.7621 mg/g。內蒙古赤峰的蒼術素含量最高，為4.4167 mg/g，陜西商洛的含量最低，為0.2481 mg/g。河北的蒼術酮含量最高，為8.4834 mg/g，陜西安康的含量最低，為0.5015 mg/g。在所有北蒼術樣品中，陜西商洛的β-桉葉醇含量最高，為30.9835 mg/g，而蒼術素含量卻最低，為0.2481 mg/g。

表3 北蒼術樣品3種成分測定結果(n=3)Tab.3 Determination results of three components in Atractylodis Rhizoma (n=3)

3 討 論

3.1 波長的選擇

用190～400 nm波長對β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮對照品進行掃描分析，發現β-桉葉醇在195 nm處吸光度最大，然后逐漸減小。蒼術素的吸收范圍較廣，在336 nm處有最大吸收。在200～210 nm之間，蒼術酮吸光度逐漸減少，到110 nm處到達低點，然后逐漸升高，到221 nm處到達高點，然后逐漸降低，直到沒有光吸收。綜合考慮，選擇200 nm作為吸收波長。

3.2 流動相比例的選擇

在波長200 nm、流速1.0 mL/min、柱溫26 ℃和柱子規格型號等條件不變的前提下，只改變乙腈和10%甲醇比例，乙腈和10%甲醇比例分別為65∶35、60∶40、59.5∶40.5、59∶41、58.5∶41.5、58∶42、55∶45。發現3種目的成分的出峰時間順序均為β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮，但是只有乙腈和10%甲醇比例為58.5∶41.5時，β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮與前后峰的分離度均大于2020版《中國藥典》規定的1.5，此時β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的保留時間分別為15.098、18.442、46.042 min。因為在蒼術素與蒼術酮保留時間之間很長時間看不到其他成分，故調整20～60 min乙腈與10%甲醇比例為58.5∶41.5～85∶15，此條件下β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮的保留時間分別為15.054、18.385、37.654 min。調整20～60 min乙腈與10%甲醇比例后，β-桉葉醇和蒼術素的保留時間基本沒有變化，而蒼術酮的保留時間縮短了8.388 min，并且蒼術酮與前后峰的分離度均大于1.5。從而篩選出本試驗的最佳流動相比例。

本試驗建立了用高效液相色譜同時檢測北蒼術中β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮含量的方法，該方法簡單、準確，為高效液相色譜用于北蒼術的質量檢測提供方法學保障。