凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞生長及腸道形態結構的影響

申維維，吳 瓊，胡 迪，溫海京，胡 婷，范礦士，王建舫，張永紅，崔德鳳

(北京農學院動物科學技術學院/獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

中國畜牧業養殖在生產中抗生素、化藥、激素等超量且不合理使用，使畜禽產品安全性降低[1]。益生菌在腸道中扮演著十分重要的角色，不僅可以調節腸道內微生物體系，還能保護機體腸道不受侵害，在發揮益生功能的同時產生活性物質和抑制有害菌物質[2]。

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)屬于芽孢桿菌屬，呈桿狀，革蘭氏陽性菌，端生芽孢，無鞭毛。最適生長溫度為45～50 ℃，最適pH值6.6～7.0，在室溫且避光的環境中其有效作用可長達720 d，主要具有“四耐”抗逆作用，具體表現為耐熱、耐氧、耐鹽、耐酸堿[3-4]。夏濤等[5]研究證明，在肉雞養殖生產中，飼喂凝結芽孢桿菌，可顯著改善肉雞生長性能并能提高飼料碳水化合物和脂肪的消化。HUNG等[6]在飼養肉雞的過程中添加凝結芽孢桿菌，結果表明該菌同樣可顯著提高肉雞的生長性能并能改善腸道吸收功能。

本試驗采取凝結芽孢桿菌BC-HYI飼喂肉雞，探究凝結芽孢桿菌BC-HYI在實際飼養過程中是否能代替抗生素的使用，從而起到減少抗生素殘留同時達到促進肉雞生長，改善腸道功能的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凝結芽孢桿菌BC-HYI保存于北京農學院獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室。3日齡健康雄性肉雞(110～140 g)，共計75只，購自北京愛拔益加家禽育種有限公司，飼養于北京農學院球蟲實驗室動物房，室溫25 ℃，濕度50%～60%。該試驗已通過北京農學院動物福利與倫理審查，編號為BUA2021003。

超凈工作臺(東聯哈爾制造公司)，電熱恒溫培養箱、全溫振蕩培養箱(上海一恒科學儀器公司)，電子天平(上海天平儀器廠)，4%多聚甲醛(Chiefeng公司)，蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天)，二甲苯無水乙醇(北京化工廠)，營養肉湯(北京奧博星)，麥康凱瓊脂(北京奧博星)，MRS培養基(solarbio)，營養瓊脂(solarbio)。

1.2 試驗設計及分組

75只肉雞經過適應性飼養3 d后，隨機分為5組：對照組、抗生素組、凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組，每組15只。

對照組為基礎日糧；抗生素組為基礎日糧加桿菌肽；凝結芽孢桿菌低劑量組為基礎日糧加凝結芽孢桿菌BC-HYI，細菌數2×107CFU/mL；凝結芽孢桿菌中劑量組為基礎日糧加凝結芽孢桿菌BC-HYI，細菌數2×108CFU/mL；凝結芽孢桿菌高劑量組為基礎日糧加凝結芽孢桿菌BC-HYI，細菌數2×109CFU/mL。

試驗期35 d，每7 d為一個周期對試驗肉雞稱量體質量、采血和剖檢。

采用的日糧為無抗生素添加的基礎日糧，主要由玉米和豆粕組成(表1)。

表1 基礎日糧組成及營養水平Tab.1 Composition and nutritional level of basal diet

1.3 飼養管理

首先對雞舍進行全面沖刷、消毒，提前2 d進行照射升溫。試驗肉雞分層飼養，每天人工給料1次，自由采食，自由飲水，雞舍內照射熱燈，保障舍內適宜的溫度和濕度，試驗1～7 d雞舍溫度控制在32～34 ℃，之后雞舍溫度控制在25 ℃左右。雞舍濕度為50%～60%，注意雞舍衛生及合理通風。

1.4 樣品采集與檢測

1.4.1 樣品采集和生長指標測定 肉雞飼養第7天、第14天、第21天、第28天和第35天早8：00，肉雞稱量體質量，稱量體質量前一天晚上禁食，自由飲水。在第14天和第28天時，每組取3只肉雞剖檢，取空腸、回腸、十二指腸腸道組織用4%多聚甲醛固定，固定24 h后進行包埋試驗。每天記錄給料質量，每組取3只肉雞采血、剖殺，稱取半凈膛質量、全凈膛質量，胸肌質量和腿肌質量，按照公式計算各項指標。

平均日采食量=采食量/試驗時間

料重比=平均日采食量/平均日增體質量

胸肌率(%)=(兩側胸肌質量/全凈膛質量)×100

腿肌率(%)=(兩側腿肌質量/全凈膛質量)×100

1.4.2 凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞腸道形態結構的影響 將空腸、回腸、十二指腸腸道制作組織切片并進行蘇木精-伊紅染色，電子顯微鏡下觀察組織形態與結構。

絨毛高度：取腸絨毛頂部到底部的距離，取3個值，計算其平均數。

隱窩深度：腸黏膜肌層至腸腺開口，取3個值，計算其平均數。

1.4.3 凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞盲腸內乳酸菌及大腸桿菌的影響 稱取0.1 g盲腸內容物于滅菌的離心管中，吸取1 mL無菌生理鹽水，充分混勻，再用滅菌的生理鹽水進行10倍倍比稀釋。

瓊脂培養基：計數乳酸桿菌，稱取27.5 g培養基于滅菌的三角瓶中，加500 mL去離子水，進行高壓滅菌。

麥康凱培養基：計數大腸桿菌，稱取26 g培養基于滅菌的三角瓶中，加入500 mL去離子水，微波爐加熱溶解，進行高壓滅菌。

采用傾注法計數：吸取0.1 mL進行稀釋倍數為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的盲腸內容物稀釋液至無菌平皿。

將高壓滅菌的MRS、麥康凱培養基倒入加有稀釋好的盲腸內容物平皿中，待培養基凝固后，放入37 ℃溫箱，24 h后進行盲腸內乳酸菌及大腸桿菌的計數。

1.5 數據統計分析

試驗數據均用SPSS20.0軟件進行統計處理，結果用均值±標準差(Mean±SD)表示，用單因素方差分析差異顯著性，主要分為四種：一是無顯著差異(P>0.05)，二是有顯著性差異P<0.05，三是有極顯著性統計學差異(P<0.01)，最后是有非常顯著性統計學差異(P<0.001)。

2 結 果

2.1 凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞生長性能的影響

2.1.1 對肉雞平均日采食量的影響 肉雞平均日采食量隨著飼養時間的增加呈逐漸上升的趨勢，飼喂前期各組之間并沒有顯著差異(圖1)。肉雞飼養35 d時，抗生素組與對照組差異極顯著(P<0.01)，凝結芽孢桿菌低劑量組非常顯著高于對照組(P<0.001)。肉雞在其他飼養時間內，凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組日采食量較對照組與抗生素組均無顯著差異(P>0.05)。

2.1.2 凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞料重比的影響 對肉雞料重比的影響見圖2。肉雞飼養21 d時，凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組料重比顯著低于對照組(P<0.05)。肉雞飼養28 d時，凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組料重比顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)。肉雞飼養35 d時，凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組料重比顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)，凝結芽孢桿菌中劑量組料重比極顯著低于對照組(P<0.01)。

2.2 凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞屠宰性能的影響

對肉雞屠宰性能的影響見表2。凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組，均呈現出不同程度提升肉雞屠宰性能的作用。肉雞飼養21 d時，抗生素組半凈膛極顯著高于對照組(P<0.01)；凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組半凈膛均非常顯著高于對照組(P<0.001)；凝結芽孢桿菌低劑量組半凈膛極顯著高于抗生素組(P<0.01)。肉雞飼養28 d時，抗生素組、凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組半凈膛均非常顯著高于對照組(P<0.001)；凝結芽孢桿菌中劑量組半凈膛極顯著高于抗生素組(P<0.01)。肉雞飼養35 d時，抗生素組、凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組半凈膛均非常顯著高于對照組(P<0.001)；凝結芽孢桿菌低劑量組半凈膛顯著高于抗生素組(P<0.05)，凝結芽孢桿菌中劑量組半凈膛極顯著高于抗生素組(P<0.01)。

表2 凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞屠宰性能的影響Tab.2 Effects of different concentrations of Bacillus coagulans BC-HYI on slaughter performance of broilers

肉雞飼養21 d天時，凝結芽孢桿菌低劑量組全凈膛極顯著高于對照組與抗生素組(P<0.01)。肉雞飼養28 d時，抗生素組與凝結芽孢桿菌低劑量組全凈膛均極顯著高于對照組(P<0.01)；凝結芽孢桿菌高劑量組全凈膛非常顯著高于對照組(P<0.001)。肉雞飼養35 d時，抗生素組全凈膛極顯著高于對照組(P<0.01)；凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組組均非常顯著高于對照組(P<0.001)；凝結芽孢桿菌低劑量組和凝結芽孢桿菌中劑量組全凈膛非常顯著高于抗生素組(P<0.001)。

肉雞飼養28 d時，凝結芽孢桿菌中劑量組腿肌率顯著高于對照組(P<0.05)。肉雞飼養35 d時，凝結芽孢桿菌中劑量組腿肌率極顯著高于對照組(P<0.01)；凝結芽孢桿菌中劑量組腿肌率顯著高于抗生素組(P<0.05)。

肉雞飼養14 d時，凝結芽孢桿菌中劑量組胸肌率非常顯著高于對照組(P<0.001)；凝結芽孢桿菌高劑量組胸肌率極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.3 凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞腸道組織形態的影響

對肉雞腸道組織形態的影響見表3。肉雞飼養14 d時，凝結芽孢桿菌中劑量組十二指腸的絨毛高度顯著高于抗生素組(P<0.05)；抗生素組空腸絨毛高度顯著低于對照組(P<0.05)，抗生素組空腸隱窩深度極顯著低于對照組(P<0.01)，凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組空腸隱窩深度均顯著高于抗生素組(P<0.05)；凝結芽孢桿菌高劑量組和抗生素組回腸絨毛高度顯著高于對照組(P<0.05)。

肉雞飼養28 d時，凝結芽孢桿菌中劑量組十二指腸絨毛高度顯著高于抗生素組(P<0.05)；抗生素組回腸絨毛高度顯著低于對照組(P<0.05)，凝結芽孢桿菌高劑量組回腸絨毛高度顯著高于抗生素組(P<0.05)，凝結芽孢桿菌中劑量組回腸隱窩深度顯著低于抗生素組(P<0.05)；各組空腸絨毛高度和隱窩深度均未見顯著差異。

肉雞飼養14 d時，凝結芽孢桿菌中劑量組十二指腸絨毛高度/隱窩深度比值顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)，凝結芽孢桿菌高劑量組十二指腸絨毛高度/隱窩深度比值極顯著高于對照組和抗生素組(P<0.01)；凝結芽孢桿菌中劑量組回腸絨毛高度/隱窩深度比值顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)。

肉雞飼養28 d時，凝結芽孢桿菌中劑量組十二指腸絨毛高度/隱窩深度比值極顯著高于對照組和抗生素組(P<0.01)，凝結芽孢桿菌高劑量組十二指腸絨毛高度/隱窩深度比值顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞盲腸內乳酸菌及大腸桿菌的影響

凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞盲腸內乳酸菌和大腸桿菌的影響見表4。

表4 凝結芽孢桿菌BC-HYI對肉雞盲腸內乳酸菌及大腸桿菌的影響 lgCFU/mLTab.4 Effect of Bacillus coagulans BC-HYI on Lactobacillus and Escherichia coli of cecum

乳酸菌方面：肉雞飼養7 d，各組之間沒有顯著差異；肉雞飼養14 d，抗生素組顯著低于對照組(P<0.05)，凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組均顯著高于抗生素組(P<0.05)；肉雞飼養21 d，抗生素組顯著低于對照組(P<0.05)，凝結芽孢桿菌低劑量組和凝結芽孢桿菌高劑量組均顯著高于抗生素組(P<0.05)，凝結芽孢桿菌中劑量組極顯著高于抗生素組(P<0.01)；肉雞飼養28 d，凝結芽孢桿菌低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，凝結芽孢桿菌中劑量組極顯著高于對照組和抗生素組(P<0.01)。

大腸桿菌方面：肉雞飼養7 d，凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組顯著低于對照組(P<0.05)，且極顯著低于抗生素組(P<0.01)；肉雞飼養14 d，凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組顯著低于對照組(P<0.05)，且極顯著低于抗生素組(P<0.01)，凝結芽孢桿菌低劑量組顯著低于抗生素組(P<0.05)；肉雞飼養21 d，凝結芽孢桿菌中劑量組極顯著低于對照組(P<0.01)，且顯著低于抗生素組(P<0.05)；肉雞飼養28 d，凝結芽孢桿菌中劑量組顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)。

3 討 論

畜禽的平均日采食量、平均日增體質量和料重比是反映益生菌制劑在實際應用中有效性和經濟性的重要指標。申維維等[7]研究表明凝結芽孢桿菌低劑量組、凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組均有不同程度提高肉雞平均日增體質量的作用，這種促進作用在肉雞飼養后期表現更為顯著，肉雞飼養28～35 d時，凝結芽孢桿菌中劑量組高于抗生素組，說明在平均日增體質量方面，凝結芽孢桿菌中劑量組在肉雞飼養28～35 d時可以替代抗生素桿菌肽的促生長作用。從21 d起，凝結芽孢桿菌中劑量組、凝結芽孢桿菌高劑量組料重比與對照組比較顯著降低，凝結芽孢桿菌BC-HYI促生長作用顯著，且隨著飼養時間的延長效果優于抗生素組。凝結芽孢桿菌BC-HYI抗逆性強，宜于在腸道生長繁殖，發揮益生作用。研究證明凝結芽孢桿菌BC-HYI具有較強的耐酸性和耐堿性[8]，其活性不會受胃酸和腸道的影響，能順利進入機體的胃腸道，在腸道生長繁殖的過程中釋放消化酶，促進機體對飼料的消化吸收，從而提高飼料利用率。KANWAR等[9]研究發現凝結芽孢桿菌在腸道內定植后會在腸道中釋放消化酶和脂肪酶，這些脂肪酶有助機體消化一些不易被機體消化利用的物質，提高機體的營養水平。OU等[10]等研究發現凝結芽孢桿菌可以促進機體較難消化的碳水化合物吸收，從而幫助機體攝取更多營養物質。凝結芽孢桿菌產生揮發性脂肪酸和肽類抑菌物質。這些小分子有機酸有效促進腸道內礦物質的吸收[11]。本研究團隊前期通過RT-HPLC技術，通過分析凝結芽孢桿菌BC-HYI代謝產物，發現含有L-乳酸、乙酸、甲酸、丙酸等有機酸[12]。

腸道是動物機體營養物質消化吸收的主要場所，腸道的結構及菌群種類與腸道功能有十分密切的關系[13]。凝結芽孢桿菌維護腸道屏障，提升機體免疫功能。常用絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度和隱窩深度的比值來判斷腸道的健康狀態。當絨毛高度增高時，說明絨毛中成熟的上皮細胞越豐富，反映出腸道的消化吸收功能越強[14]；隱窩深度主要影響腸上皮細胞的生成速度，處于隱窩基層的細胞具有分化能力，可以分化出許多新的細胞，這些新產生的細胞會逐漸遷移到絨毛頂端，最后變為腸上皮細胞，幫助機體消化營養物質[15-16]。當腸道隱窩深度變低時，隱窩底部分化出來的細胞到絨毛頂端的路程就會縮短，腸上皮細胞產生、更新的速率也會加快，進而增強腸道的吸收能力；當絨毛高度/隱窩深度比值降低時，說明小腸內腸黏膜可能受到損傷，導致小腸的吸收能力下降，反之，當絨毛高度/隱窩深度比值升高時，說明小腸內結構良好，腸黏膜完整，吸收功能提升[17-18]。王政等[19]發現飲水中添加106CFU/mL的凝結芽孢桿菌，具有增加白羽雞盲腸中的乳酸菌數量，抑制大腸桿菌生長，有效改善腸道中微生物體系的作用，并顯著提高白羽雞空腸的絨毛高度/隱窩深度比值，改善白羽雞腸道的消化吸收功能，與本研究結果一致。

4 結 論

2×108CFU/mL凝結芽孢桿菌BC-HYI可以改善腸道形態結構，調節盲腸內乳酸菌和大腸桿菌的生長；對肉雞具有顯著促生長作用。