三種結(jié)核分枝桿菌檢測方法在高原地區(qū)臨床實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用

趙文君，李子安

(青海省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，青海省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810007)

肺結(jié)核是世界范圍內(nèi)單病因致死率較高的疾病之一，由耐酸結(jié)核分枝桿菌引起的慢性呼吸道傳染性疾病[1]。由于高原地區(qū)高寒缺氧紫外線強(qiáng)等特殊地理環(huán)境，特別是在高海拔地區(qū)地廣人稀，交通不便利，醫(yī)療設(shè)施衛(wèi)生條件落后，相當(dāng)一部分患者就診不及時，治療不正規(guī)[2]。高原部分地區(qū)海拔高度3 000米以上,具有低壓低氧、寒冷、干燥、晝夜溫差大、輻射強(qiáng)度高等高原環(huán)境特點(diǎn)，對人體免疫系統(tǒng)功能可造成不同程度的影響，低氧環(huán)境可引發(fā)肺纖維化形成，肺血管重新分布，呼吸系統(tǒng)疾病成為高原地區(qū)的常見病、多發(fā)病，特別是在免疫機(jī)能低下的老年人中肺結(jié)核發(fā)病率呈明顯的上升趨勢[3]。高原地區(qū)成為結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，近年來隨著國家的發(fā)展，高原地區(qū)衛(wèi)生醫(yī)療條件的改善，各級醫(yī)院集中開展防治工作，有效降低了結(jié)核病發(fā)病率和死亡率，但結(jié)核分枝桿菌預(yù)防與檢測仍是診斷重點(diǎn)和難點(diǎn)[4-5]，肺結(jié)核實(shí)驗(yàn)室診斷主要有病原學(xué)方法、免疫學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)方法三類[6]，病原學(xué)方法學(xué)檢測包括涂片抗酸染色法、培養(yǎng)法；免疫學(xué)檢測主要是進(jìn)行結(jié)核抗體檢測，蛋白芯片法也是以結(jié)核分枝桿菌特異性抗體檢測為基礎(chǔ)；分子生物學(xué)檢測主要有熒光定量PCR技術(shù)和芯片雜交[7]。傳統(tǒng)的涂片抗酸染色法和培養(yǎng)法在結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷上是金標(biāo)準(zhǔn)，但存在培養(yǎng)時間長、影響因素多，陽性率不高等諸多局限。

1 資料與方法

1.1一般資料：本次研究所采用標(biāo)本來源于2018年3月～2019年12月青海省人民醫(yī)院臨床送檢痰樣本。將臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，乏力、消瘦、盜汗等，出現(xiàn)咳嗽、咯痰的時間長達(dá)14天以上或咳出帶血痰液等可疑癥狀患者分組[8]，疑似肺結(jié)核組190例，肺結(jié)核組60例，非結(jié)核組50例。每組納入資料根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、影像學(xué)和實(shí)驗(yàn)室診斷差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肺結(jié)核診斷，標(biāo)本的采集、運(yùn)送和保存按《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[9](WS 288-2017)執(zhí)行。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2儀器與試劑：美國公司QuantStudio5熒光定量PCR儀；蘇凈集團(tuán)安泰公司B2型生物安全柜；日本奧林巴斯株式會社生產(chǎn)的CX-31生物顯微鏡；臺灣貝索商品化抗酸染色液；博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司提供改良羅氏培養(yǎng)基；湖南圣湘生物科技公司提供結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒。實(shí)驗(yàn)室所用所有試劑、 耗材均在有效期內(nèi)，并按說明書進(jìn)行操作和使用。

1.3方法

1.3.1痰涂片抗酸染色：采用最經(jīng)典的萋尼抗酸染色法，按照《痰涂片鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[10]進(jìn)行標(biāo)本處理、涂片、染色、鏡檢操作，用 100×油鏡觀察，結(jié)核分枝桿菌在藍(lán)色背景下呈細(xì)長略彎曲的紅色桿菌。

1.3.2改良羅氏培養(yǎng)基：按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》培養(yǎng)痰液標(biāo)本處理、培養(yǎng)及鑒定，使用大腸埃希菌(ATCC 25922)作為陰性質(zhì)控，結(jié)核分枝桿菌質(zhì)控菌株H37Ra作為陽性質(zhì)控，有菌落生長并經(jīng)萋尼抗酸染色法驗(yàn)證后報告結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性。發(fā)現(xiàn)有非結(jié)核分枝桿菌生長時報告污染，本次研究使用改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)時未發(fā)現(xiàn)有非結(jié)核分枝桿菌生長。

1.3.3TB-DNA PCR操作：按照結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)本前處理和檢測，通過QuantStudio5熒光定量 PCR 儀進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1三種檢測方法對190例疑似肺結(jié)核患者檢測結(jié)果比較：涂片抗酸染色法、改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法、TB-DNA PCR 檢測190例疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本的陽性率分別為 13.2%、39.5%、47.4%。TB-DNA PCR 陽性率高于改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法高于涂片抗酸染色法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 190例疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本陽性率比較

2.2三種檢測方法對60例肺結(jié)核患者及50例非結(jié)核病患者檢測結(jié)果比較：三種方法檢測60例肺結(jié)核患者陽性例數(shù)分別為10例、28例、51 例，檢測50例非結(jié)核病患者陽性例數(shù)分別為0例、8例、12例。

2.3三種檢測方法診斷效能：三種方法在檢測60例肺結(jié)核患者及50例非結(jié)核患者中，TB-DNA PCR靈敏度高于改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法，改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法靈敏度高于涂片抗酸染色法，靈敏度分別為85.0%，46.7%，16.7%，三種檢測方法的陽性預(yù)測值分別為80.9%，77.8%，100%，陰性預(yù)測值分別為80.8%，58.4%，50.0%，從三種方法學(xué)正確度比較，TB-DNA PCR正確度最高為80.9%，其次為改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法和涂片抗酸染色法。見表2。

表2 三種檢測方法診斷效能(%)

3 討論

痰液中結(jié)核分枝桿菌檢測，是發(fā)現(xiàn)結(jié)核病傳染源的主要途徑和手段，它對結(jié)核病診斷確認(rèn)、傳染源控制、治療方案的確定和療效評估具有十分重要的意義。結(jié)核分枝桿菌檢測方法中比較傳統(tǒng)也是應(yīng)用最廣的涂片抗酸染色法和改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法。涂片抗酸染色法由于其操作簡單、成本低、不需要特殊儀器、易推廣、簡單快速等優(yōu)點(diǎn)在基層實(shí)驗(yàn)室得到廣泛的應(yīng)用，仍然是一種經(jīng)濟(jì)的檢測方法。此研究內(nèi)容中涂片抗酸染色法與改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法和TB-DNA PCR法比較，其檢測靈敏度低(16.7%)，特異性高(100%)，與國內(nèi)文獻(xiàn)報到基本一致[11-12]。涂片抗酸染色法需要痰液中有一定數(shù)量的結(jié)核分枝桿菌才能檢出[13]，在疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本檢測中陽性率低(13.2%)，與其他兩種檢測方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法是檢測結(jié)核分枝桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)[14]，但是由于檢測周期長，一般需要3～8周，從而影響結(jié)核病的診斷和治療，因此這兩種結(jié)核分枝桿菌的檢測方法都存在較大的缺陷。

近年來，分子生物學(xué)檢測方法的迅速發(fā)展和推廣很好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌檢測方法的缺陷。結(jié)核分枝桿菌DNA熒光定量PCR法都是通過PCR技術(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行定量檢測結(jié)核分枝桿菌的DNA，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，對190例疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測，TB-DNA PCR檢測陽性率(47.4%)明顯高于傳統(tǒng)改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法(39.5%)及涂片抗酸染色法(13.2%)，檢測結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對肺結(jié)核確診患者痰液標(biāo)本檢測靈敏度(85.0%)明顯高于涂片抗酸染色法(16.7%)和改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法(46.7%)，特異性也能夠滿足檢測需要，TB-DNA 檢測法陽性預(yù)測值(80.9%)明顯高于改良羅氏培養(yǎng)基法(77.8%)，陰性預(yù)測值(80.8%)明顯高于改良羅氏培養(yǎng)基法(58.4%)和涂片抗酸染色(50.0%)。PCR檢測法的診斷率最高(80.9%)，相比傳統(tǒng)的涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法，TB-DNA PCR分子生物學(xué)檢測方法均為敏感、特異、快速、可靠的檢測方法[15]。越來越多的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)被發(fā)展，都有各自優(yōu)勢，現(xiàn)代的分子生物學(xué)方法仍然無法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的結(jié)核診斷方法，臨床醫(yī)生需要聯(lián)合運(yùn)用，不斷發(fā)展更高性價比的檢驗(yàn)技術(shù)才能對結(jié)核感染進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診治[16]。