低氧聯(lián)合遠隔缺血預適應對大鼠缺血再灌注腎損傷的保護作用

梅霄陽，閆林軒，李 麗，王勤章，李應龍

(1.石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000；3.成都市第五人民醫(yī)院，四川 成都 610000)

缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury，IRI)是指由多種原因引起的組織或器官缺血以及血流灌注恢復造成損傷進一步加重的現象。腎臟作為高灌注器官對IRI較敏感，臨床上常見于腎移植、部分腎切除術等過程中[1-2]。腎缺血再灌注損傷是缺血性急性腎損傷的重要損傷環(huán)節(jié)，盡管目前治療技術有了明顯進步，如血液凈化、選擇性動脈阻斷等技術的開展，但是休克、膿毒癥等造成的急性腎損傷仍嚴重威脅著患者的生命安全。不僅影響移植腎早期功能恢復及長期存活，而且病死率較高[3]，但是阻斷血流的腎部切除手術仍然是泌尿外科治療腎腫瘤的主要手段。腎缺血再灌注損傷的病理生理機制十分復雜，如何減輕缺血再灌注過程帶來的組織器官損害成為目前臨床工作亟需解決的難題。低氧預適應(Hypoxic preconditioning，HPC)和遠隔缺血預適應(Remote ischemic preconditioning，RIPC)作為一種新穎的預處理方法成為目前國內外研究的熱點，其在多個器官如骨骼肌、腎、肝表現出對IRI的保護作用[4-7]。HPC指預先低劑量非致死性短時間重復低氧處理，誘發(fā)機體獲得對隨后急性致死性損傷的耐受能力。RIPC即預先在遠離缺血臟器的其他組織或器官實施短時間缺血再灌注處理增加對長時間缺血的抵抗力的過程。然而，低氧聯(lián)合遠隔缺血預適應對腎缺血再灌注損傷是否存在協(xié)同保護作用及其機制，目前尚缺乏相關報道。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑：TUNEL試劑盒(武漢博士德生物過程有限公司)；Bcl-2兔多克隆抗體、Caspase3兔多克隆抗體(Abcam公司)，APY-250IM恒溫恒濕低氧艙(杭州得聚儀器設備有限公司)；醫(yī)用彈力繃帶；正置熒光顯微鏡(Olympus)。

1.2研究方法

1.2.1腎臟IRI模型制備：參考本實驗室既往方法，實驗大鼠術前禁食6 h，以3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉成功后，將其俯臥位固定，常規(guī)手術區(qū)消毒、鋪巾，暴露并游離腎臟，切除右側腎臟，分離左側腎動脈，無創(chuàng)動脈夾夾閉腎動脈，避免損傷周圍大血管及輸尿管，觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色，說明缺血成功，反之缺血失敗。持續(xù)缺血45 min，恢復血流，再灌注24 h。

1.2.2實驗動物及分組：選擇健康清潔級SD雄性大鼠40只，體重250～300 g之間，周齡12周左右，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物標準SPF級。動物實驗經過本院動物管理和使用委員會批準。隨機均分五組，假手術組，切除右腎，僅暴露左腎；缺血再灌注組，低氧預適應組，缺血再灌注前將實驗動物置于恒溫恒濕低氧艙內，正常光照，充入氮氧混合氣體，將氧濃度維持在12%，15 h/d(17∶00～8∶00)，持續(xù)4周；遠隔缺血預適應組，缺血再灌注前24 h用醫(yī)用彈力繃帶施加對左下肢圓形壓縮的10 min缺血和10 min再灌注3個循環(huán)；低氧預適應聯(lián)合遠隔缺血預適應組，缺血再灌注模型制備前24 h，先進行低氧預適應，再進行對左下肢的10 min缺血和10 min再灌注3個循環(huán)。

1.2.3組織處理與標本采集：各組大鼠造模過程中如出現死亡，以同等方法補充。所有動物造模實驗前6 h禁食，允許自由飲水。再灌注24 h后，進行組織處理及標本采集，戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，行下腔靜脈采血，取血后打開胸腔，用冰鹽水經左心室反復灌洗腎臟至顏色蒼白，取出左側腎臟，去除被膜，行縱軸冠狀面剖開，置于4%多聚甲醛固定48 h。

1.2.4腎功能血生化檢測：采集的大鼠血標本，離心后取上清液送往石河子大學第一附屬醫(yī)院檢驗科。采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平。

1.2.5腎組織病理學檢查：取出多聚甲醛固定的腎組織，脫水透明，石蠟包埋，切片后行HE染色，200倍光鏡下觀察病理形態(tài)并攝片，進行Paller評分[8]。評分標準為：腎小管擴張明顯計1分；腎小管上皮細胞腫脹或扁平1分；刷狀緣損傷1分；刷狀緣脫落2分；管型形成2分；腎小管管腔存在脫落、壞死(尚未形成管型或細胞碎片)1分；腎小管正常0分。由專業(yè)的病理醫(yī)師每個視野隨機選擇10個腎小管，參照評分標準評估損傷程度。

1.2.6TUNEL法檢測腎細胞凋亡：TUNEL染色后，400倍熒光顯微鏡下觀察，每張片子隨機選取5個不重疊的視野拍照，陽性細胞為綠色熒光，采用ImageProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計各類細胞數，取其平均值計算凋亡指數。細胞凋亡指數(AI)=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.2.7免疫組化檢測腎組織caspase3和bcl-2蛋白表達：取石蠟切片，嚴格參照試劑盒實驗步驟操作，免疫組化染色后，陽性細胞胞質呈棕黃色，于400倍光鏡下觀察切片，每張切片隨機選擇5個視野，應用顯微成像系統(tǒng)采集圖像，并采用ImageProPlus6.0對圖像進行半定量分析，計算各組caspase3和bcl-2陽性細胞的平均光密度值(IOD/Area)。

2 結果

2.1腎功能血生化檢測結果：缺血再灌注組、低氧預適應組、遠隔缺血預適應組及低氧聯(lián)合遠隔缺血預適應組血清BUN和Scr水平均較假手術組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，低氧預適應組、遠隔缺血預適應組及聯(lián)合組BUN和Scr水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與低氧預適應或遠隔缺血預適應組比較，聯(lián)合組對腎功能水平改善更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血生化BUN和Scr水平

2.2腎組織病理改變：HE染色后光鏡下可見假手術組結果清晰，無明顯異常，腎小管上皮細胞排列整齊，刷狀緣完好，管腔未見管型及管腔堵塞。缺血再灌注組組織結構明顯紊亂，可見腎小管擴張明顯，上皮細胞出現不同程度腫脹及空泡變性，部分刷狀緣消失，管腔出現壞死脫落的細胞甚至管型，腎間質充血以及炎細胞浸潤。低氧預適應組和遠隔缺血預適應組腎小管擴張程度減輕，上皮細胞壞死及管型減少。偶見間質充血及炎細胞浸潤。聯(lián)合組腎臟病理損害明顯減輕，僅表現為腎小管輕度擴張，偶見管型。見圖1。Paller評分見表2。

注：A:假手術組；B：缺血再灌注組；C：低氧預適應組；D：遠隔缺血預適應組；E：低氧聯(lián)合遠隔缺血預適應組圖1 各組大鼠腎組織病理改變(×200)

表2 各組大鼠腎組織Paller評分(n=8)

2.3腎臟細胞凋亡情況：假手術組組織中極少數細胞發(fā)生凋亡，低氧預適應和遠隔缺血預適應組均可減輕缺血再灌注損傷導致的細胞凋亡。而與低氧預適應和遠隔缺血預適應相比，聯(lián)合組的細胞凋亡水平顯著降低。見圖2。凋亡指數見表3。

注：A:假手術組；B：缺血再灌注組；C：低氧預適應組；D：遠隔缺血預適應組；E：低氧聯(lián)合遠隔缺血預適應組圖2 各組大鼠腎組織細胞凋亡情況(×400)

表3 各組大鼠腎組織細胞凋亡指數(n=8)

2.4免疫組化觀察Caspase3和Bcl-2蛋白的表達水平：與假手術組相比，腎缺血再灌注組大鼠的Caspase3表達升高，Bcl-2表達降低；與缺血再灌注組相比，低氧預適應和遠隔缺血預適應組Bcl-2表達升高，Caspase3表達降低；而與低氧預適應和遠隔缺血預適應組相比，聯(lián)合組Bcl-2表達明顯升高，而Caspase3表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。平均光密度值見表4。

注：A:假手術組；B：缺血再灌注組；C：低氧預適應組；D：遠隔缺血預適應組；E：低氧聯(lián)合遠隔缺血預適應組圖3 各組大鼠Caspase3和Bcl-2表達情況(×400)

表4 各組大鼠Caspase3和Bcl-2平均光密度值(IOD/Area)(n=8)

3 討論

腎臟IRI是一種臨床常見的病理生理過程，目前國內外對于如何減輕腎臟IRI進行了大量研究，部分成果已經運用到了臨床工作中，但大多是藥物干預或者直接干預腎臟本身。藥物干預如雌激素等副作用較大，且隨著患者年齡增長可能出現對藥物代謝率降低[9]。直接對腎臟干預不僅臨床操作不方便，而且是一種有創(chuàng)操作，且增加手術時間。低氧預適應和遠程缺血預適應作為新興的非藥物干預措施已經在多個器官如肝、腎、腦等表現出對IRI的保護作用。不僅操作簡便，費用較低，而且對患者損傷較小。本實驗聯(lián)合應用低氧預適應及遠隔缺血預適應探討了其對腎臟是否存在協(xié)同保護作用及其機制。

大量研究認為雌激素對腎IRI具有保護作用，因此筆者選擇雄性大鼠作為研究對象保證樣本均一性，也有證據表明這種性別對腎IRI敏感性更高。本實驗結果顯示腎IRI組BUN、Scr水平較假手術組明顯升高，說明模型構建成功。與腎IRI組比較，低氧預適應組、遠隔缺血預適應組及聯(lián)合組上述指標降低。同時，光鏡下病理形態(tài)結果可見細胞壞死、水腫程度等明顯減輕，提示兩種預適應均能減輕腎IRI，改善腎功能。且與兩種單獨預適應相比，兩者聯(lián)合對腎功能及病理形態(tài)改善更明顯。

腎缺血再灌注損傷發(fā)病機制十分復雜，常見的有氧化應激、炎性反應、鈣超載以及細胞凋亡等，近年來大量研究表明，細胞凋亡在缺血再灌注過程中占重要地位，是腎IRI的重要環(huán)節(jié)[10-11]。抑制細胞凋亡過程可以有效預防腎IRI的發(fā)生。本實驗TUNEL法結果顯示與腎IRI組相比，低氧預適應組、遠隔缺血預適應組及兩者聯(lián)合組細胞凋亡指數AI明顯降低，說明三種干預措施在一定程度上均能減少大鼠腎組織細胞凋亡。與低氧預適應或遠隔缺血預適應組比較，兩者聯(lián)合細胞凋亡更少。查閱文獻，腎IRI過程中的細胞凋亡由一系列繁瑣的級聯(lián)反應所引起，有多種凋亡相關蛋白參與，而Bcl-2和Caspase3是其中重要的兩種凋亡蛋白[12]。大量證據表明在腎IRI過程中提升Bcl-2的表達可以抑制細胞凋亡，而抑制內源性Bcl-2蛋白的表達或者消除Bcl-2反而會促進細胞凋亡加重腎IRI[13]。本實驗過程免疫組化結果顯示，與腎IRI模型組比較，低氧預適應、遠隔缺血預適應及聯(lián)合組Bcl-2蛋白表達增多，兩者聯(lián)合組增多更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且其與各組間細胞凋亡趨勢相反，兩者聯(lián)合組細胞凋亡較少，這表明低氧預適應及遠隔缺血預適應在腎IRI過程中可能通過提高Bcl-2表達減少細胞凋亡從而改善腎IRI。

目前較多研究認為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase依賴的細胞凋亡是缺血再灌注損傷過程中誘導細胞凋亡的重要途經。激活的Caspase以瀑布式的活化方式活化，而Caspase3是其中最關鍵的一種蛋白酶。Caspase3是一種在正常細胞以無活性酶原形式存在的蛋白酶，其位于細胞凋亡下游，是各種細胞凋亡通路的必經之路。受多種凋亡刺激因素介導后激活，活化的Caspase3可引起一系列細胞形態(tài)學變化，如細胞固縮、凋亡小體形成和DNA分解等，最終促使細胞凋亡發(fā)生[14]。天然或合成的Caspase3抑制劑可以顯著減輕甚至阻斷多種刺激引起的細胞凋亡[15]。本實驗免疫組化結果顯示，腎IRI組Caspase3蛋白表達明顯升高，低氧預適應、遠隔缺血預適應及聯(lián)合組Caspase3蛋白表達較腎IRI模型組降低。與低氧預適應或遠隔缺血預適應相比，兩者聯(lián)合組降低更明顯。Caspase3蛋白表達與各組間細胞凋亡分布一致。說明低氧預適應及遠隔缺血預適應能夠通過抑制Caspase3表達來抑制細胞凋亡發(fā)生。

綜上所述，低氧預適應及遠隔缺血預適應均能降低腎IRI，且低氧聯(lián)合遠隔缺血預適應對腎IRI改善更明顯，其機制可能是通過下調Caspase3表達和上調Bcl-2蛋白表達，從而抑制細胞凋亡有關。但其對腎IRI過程細胞凋亡的具體調控機制仍待進一步研究。