膿毒癥大鼠急性腎損傷炎性因子的表達水平及意義

曾 民，佟 晶，張文超，凌 林

(南華大學附屬第二醫院，湖南 衡陽 421001)

膿毒癥(sepsis)是嚴重感染導致宿主反應失調，進而引起致命性多器官功能障礙的危重疾病[1]，其同時出現了組織低灌注，這是由于致病原微生物侵入機體并繁殖以及其代謝產物在機體內引起微循環障礙從而誘導嚴重的炎性反應及多器官功能障礙[2]，據統計全球每年超過1 800萬嚴重膿毒癥患者，且每年按1.5%～8.0%的速度增多。目前數據也顯示在重癥監護病房中有超過50%的多臟器功能障礙與膿毒癥有關，并且其中50%～66% 的膿毒癥患者會發生急性腎損傷(AKI)，并且其病情發展迅速，病死率高[3-4]，所以膿毒癥致 AKI 的高發病率和高病死率已成為重癥醫學科面臨的重要難點和挑戰。目前對于膿毒癥性急性腎損傷與抑制促炎因子的合成和釋放的上游信號轉導的調控機制尚不清楚，因此本研究以AKI 模型大鼠為載體，考察膿毒癥大鼠NF-κB 信號通路中關鍵信號傳導蛋白的影響，進一步探討AKI病癥下可能的炎癥反應作用靶點及調控機制，為后續臨床用藥研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取雄性 SD大鼠40只，SPF級，體重 20～28 g，由南華大學動物實驗中心提供。實驗采用LPS(美國 Sigma 公司)及TNF-a、IL-6、IL-10 酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國 eBioscience 公司)和p65、IκBα 抗體(英國 Abcam 公司)。

1.2研究方法

1.2.1動物模型建立及分組：40只大鼠隨機分為對照24 h組，對照48 h組，模型24 h組和模型48 h組各10只，對照24 h組和對照48 h組大鼠予以腹腔注射生理鹽水2 ml，模型24 h組和模型48 h組大鼠予以腹腔注射脂多糖(15 mg/kg) 2 ml建立膿毒癥急性腎損傷模型。對照24 h組及模型24 h組于建模術后24 h后取大鼠腎臟標本并凍存，采集大鼠的靜脈血；對照48 h組及模型48 h組于術后48 h后取標本，本研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2.2血清炎性因子(TNF-a、IL-6、IL-10)水平檢測：ELISA 檢測大鼠靜脈血中 TNF-a、IL-6、IL-10含量，兩組均取處死大鼠靜脈血3 ml，2 000 r /min離心10 min，分離所得血清置于-80 ℃ 冰箱備檢。TNF-a、IL-6、IL-10檢測操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.3血清肌酐(SCr)水平及大鼠小便腎損傷分子-1(KIM-1)表達水平檢測：采用ELISA法檢測大鼠血清KIM-1表達水平，方法同上，反應結束后各孔于波長 450 nm 的酶標儀上讀取光密度(D)值。采用全自動多功能生化分析儀按照步驟進行檢測大鼠血清SCr水平。

1.2.4蛋白免疫印跡法檢測腎組織中p65，IκBα蛋白表達水平：稱取適量凍存的大鼠腎組織，用RIPA裂解液提取蛋白，并用BCA 法測定蛋白濃度。各組取總蛋白樣品50 μg，然后行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS PAGE)，再用濕法轉膜法轉至硝酸纖維素濾膜上后予以5% 脫脂牛奶封閉 2 h，TBST 洗滌后加入一抗稀釋液( 1∶1 000)，4 ℃孵育1夜。次日 TBST 洗滌后加入辣根過 氧化物酶 ( HRP)藕聯的羊抗兔 IgG( 1∶1 000)，室溫孵育2 h。TBST 洗膜3次后ECL法顯色，于凝膠成像系統中采集圖像信息分別計算NF-κB p65及核因子及IκBα蛋白相對表達量，實驗重復3次結果取平均值。

2 結果

2.1各組大鼠炎性因子水平比較：模型24 h組及模型48 h組大鼠水平炎性因子水平高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，模型48 h組IL-10較模型24 h組下降明顯，但TNF-a、IL-6上升明顯，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠炎性因子水平比較

2.2各組大鼠p65，IκBα蛋白磷酸化水平比較：模型24 h組及模型48 h組大鼠p65，IκBα蛋白磷酸化水平高于對照組大鼠，差異均有統計學意義(P<0.05)；并且模型48 h組較模型24 h組上升明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠p65，IκBα蛋白磷酸化水平比較

2.3各組大鼠腎功能比較：模型48 h組大鼠KIM-1、SCr水平高于對照48 h組大鼠，差異均有統計學意義(P<0.05)；且模型24 h組KIM-1水平高于對照24 h組，差異有統計學意義(P<0.05)；但模型24 h組SCr水平與對照24 h組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎功能比較

3 討論

膿毒血癥在臨床上是一種十分常見的能夠導致機體多個臟器功能發生損傷的病理過程，其發病機制非常復雜[5]，目前大家多支持全身炎性反應網絡效應是其重要因素，由感染等多種誘因導致機體免疫失衡，被炎性反應網絡進行級聯放大，最終導致全身炎性反應綜合征[6-7]，AKI是其嚴重的常見并發癥之一。KIM-1是一種腎臟近曲小管上皮細胞表達的跨膜蛋白，在正常腎臟內表達極低，近年有研究表明KIM-1可作為急性腎損傷的早期特異性生物標志[8]。本實驗中數據顯示早期模型24 h組與對照24 h組SCr差異無統計學意義(P>0.05),模型24 h組及模型48 h組KIM-1表達水平較對照24 h組、對照48 h組均明顯升高(P<0.005)，再次證明KIM-1可以用作早期監測評價腎功能的有效指標。LPS是革蘭陰性菌外膜的主要成分，可作為膿毒癥動物模型建立的主要致病原，能誘導中性粒細胞、巨噬細胞等免疫細胞及產生大量炎性因子和氧自由基[9]。 TNF-α、IL-6和 IL -1β 是先天免疫系統對感染最初反應的重要促炎因子，能夠引發細胞因子風暴的發生，并放大機體的炎性反應級聯反應。 本研究發現，模型24 h組及模型48 h組TNF-α、IL-6 水平較對照24 h組、對照48 h組均明顯升高(P<0.05)，IL-10是一種由B細胞刺激激活的內源性抑炎因子，由B細胞、T細胞和巨噬細胞產生，可以抑制免疫反應及應答。實驗中模型24 h組及模型48 h組IL-10高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.005)，但模型48 h組IL-10較模型24 h組下降明顯，而TNF-a、IL-6上升明顯，差異均有統計學意義(P<0.05)。結合實驗中大鼠腎功能改變說明膿毒血癥早期引起大量釋放促炎因子，并導致后期抗炎因子的不足及促炎因子的級聯反應，再次證明TNF-α、IL-6 及 IL-10參與了膿毒血癥性AKI的發生、發展過程。

NF-κB 是早期誘導炎性因子釋放的核轉錄因子，在靜息狀態下，NF-κB p65 和胞漿內的抑制蛋白IκB結合以無活性的復合物形式存在。當機體遭受刺激后，IκB發生磷酸化并降解，與NF-κB p65二聚體解離，使NF-κB p65 磷酸化再轉移至胞核內，從而調控炎性因子等基因的轉錄和表達[9]。本實驗結果表明，AKI 模型大鼠腎組織中p65，IκBα蛋白磷酸化水平均顯著升高(P<0.05)，并且隨著時間的推移，大鼠腎組織中p65，IκBα蛋白磷酸化水平升高更加明顯(P<0.05)，且TNF-α、IL-6及IL-10水平較對照組也顯著上升(P<0.05)，但模型48 h組IL-10較模型24 h組下降明顯(P<0.005)，表明膿毒癥后期大鼠出現免疫抑制表現，表明模型大鼠腎組織中 NF-κB信號通路被激活，進而促進了下游炎性因子的轉錄表達。

綜上所述，NF-κB是膿毒癥發生發展過程中的重要通路，是一種多效性、多向性的調控因子，是致炎-抗炎的核心通路，在膿毒癥的發生發展過程中發揮著至關重要的作用，所以通過本研究可試想尋找一種抑制 NF-κB 通路的藥物治療膿毒癥。