MPO基因多態性與川崎病易感性及冠狀動脈損害的 相關性研究

王福玲，陳麗清，肖蓉，馬慧芳

(內蒙古自治區婦幼保健院，內蒙古 呼和浩特 010000)

0 引言

川崎病(Kawasaki disease，KD)又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征，是一種目前病因不明的以急性發熱、多形性皮疹，頸部淋巴結腫大等為臨床表現的全身性血管炎綜合征，亞洲地區多見，好發于5歲以下幼兒[1]。首次由日本學者川崎富作報道，以發熱、球結膜充血、口腔黏膜改變、手足硬腫、皮疹、頸部淋巴結腫大為典型臨床癥狀，此外病變易累及全身中小血管，其中較為嚴重的是累及冠脈血管，不僅可引發血管炎、冠狀動脈損害(Coronary artery lesions，CAL)，部分嚴重病例可形成巨大冠狀動脈瘤，甚至較少部分患兒存在冠狀動脈狹窄與血栓形成、猝死等，且兒童時期發生的CAL可增加成年早期發生心肌缺血、冠狀動脈粥樣硬化的危險[2]，因此KD所致CAL是目前臨床治療非常棘手的嚴重問題，尋找其病因，改善患兒預后更是刻不容緩。

近年來，根據大量KD的流行病學調查數據發現，KD的發生與其遺傳性及地區特異性有著重要聯系。且經過全基因組關聯分析(GWAS)與全基因組連鎖的分析研究[3]，已發現多個基因的SNP位點參與KD的發生發展，故推測KD的發生與遺傳性有關。髓過氧化物酶(MPO)是在中性粒細胞的嗜天青顆粒中發現的氧化酶，是血紅素過氧化物酶家族成員之一，是中性粒細胞活化的標志物，大量研究證實MPO通過氧化參與血管炎癥的發生、發展[4]。臺灣學者發現該基因與KD易感性相關[5]，大陸僅見熊志[6]、趙宗秀[7]兩位學者報道該基因與KD易感性關系，且觀點不一致。由于地域及人群的差異，本研究探討內蒙古中部地區漢族KD兒童的MPO基因rs2333227位點的多態性與KD易感性及其KD臨床特點的關聯性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年10月至2019年1月連續在內蒙古自治區婦幼保健院住院診斷KD且規范治療的75例患兒為病例組。在相同時期選擇75例在內蒙古自治區婦幼保健院兒保科健康體檢兒童為對照組(均排除心、肺、肝、腎及血液系統疾病)。病例組根據心臟超聲有無累及冠狀動脈，將KD患兒歸為CAL組，NCAL組。

川崎病診斷標準[8]：

發熱至少五天，至少五種主要臨床特征中的四種：

(1)雙眼結膜充血，非化膿性；

(2)口腔和嘴唇的變化：裂開和紅斑的嘴唇，草莓舌；

(3)多形性皮疹：斑丘疹樣、多形性紅斑或猩紅斑樣皮疹等多見，累及四肢、軀干和會陰；

(4)四肢的變化：多在第2周和第3周出現手足紅斑，手部和足部硬腫；

(5)常有一側的淋巴結發生腫大(直徑＞1.5厘米)，為非特異性改變。

除外其他系統疾病(如藥物過敏、幼年特發性關節炎、葡萄球菌燙傷皮膚綜合征、猩紅熱、病毒感染等確診為KD。

冠狀動脈損害診斷標準[9]：

(1)冠脈內徑Z值2.0-2.5是近端冠脈的臨界值，故遠端冠脈及其他非冠脈血管須大于等于相鄰近血管內徑的1.5倍被定義為冠脈異常。

(2)依據Z值對冠狀動脈異常的分類：①無受累：Z值＜2；②僅擴張：Z值2～＜2.5；或初始Z值＜2，隨訪中Z值下降幅度≥1；③小型冠狀動脈瘤：Z值≥2.5～＜5；④中型冠狀動脈瘤：Z值≥5～＜10；且內徑絕對值＜8mm；⑤巨大冠狀動脈瘤：Z值≥10，或內徑絕對值≥8mm。

明確KD診斷后均給予靜點丙種球蛋白2g/(kg·d)及口服阿司匹林規范治療。入選的150例研究對象均為我區無血緣關系的漢族兒童，且籍貫在內蒙古地區，本研究已得到內蒙古自治區婦幼保健院倫理委員會準許，并取得所有研究對象的監護人知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 KD 患兒臨床資料收集

收集KD患兒發病初期的一般臨床資料，包括性別、年齡、皮疹、口腔黏膜病變、手足水腫等癥狀，以及患兒生化、心臟超聲以及影像的資料。

1.2.2 MPO 基因多態性分析

使用一次性含有乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管抽取研究對象靜脈血2mL，對兩組血液標本分別標記(病例組A1-A75，對照組D1-D75)，并立即放置在冰箱中-80℃存儲，半年內將標本外送至北京六合華大基因公司進行基因測序檢測。通過康為世紀生物科技有限公司生產的血液基因試劑盒從血中提取DNA，根據美國國立生物技術信息中心(national center for Biotechnologyinformation，NCBI)公布的MPO基因序列針對rs2333227位點，使用軟件Primer Premier 5.0設計含有單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點的引物，上游引物為：5’-TTCAAGCGATTCTTCTGC-3’；下游引物為：5’-AGGGTCCTCCTTCCTGTG-3’。PCR總反應體系50μL，含有10倍PCR反應緩沖液5μL，dNTP混合液4μL，上下游引物各1μL，EX公司Taq酶1.25U；反應條件：循環條件為：95℃ 15s→(95℃ 15s →50℃ 5s→60℃ 90s)×35cycles→終止反應。分別取2μL擴增的產物利用內切酶BstN I進行酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3 統計學分析

運用SPSS 20.0 (SPSS Inc.，Chicago，USA)軟件進行統計分析。計量資料采用(±s)進行統計描述，正態性檢驗采用單樣本K-S擬合優度法，兩組均數的比較采用t檢驗，不服從正態分布的組間比較采用秩和檢驗。計數資料采用率進行統計描述，統計推斷采用χ2檢驗。運用Haploview軟件進行Hardy-Weinberg平衡定律檢驗病例組和對照組及CAL和NCAL組，均符合該定律(P＜0.05)。基因型頻率和等位基因頻率分布應用頻數和百分率(%)表示。采用logistic回歸分析探討MPO基因rs2333227位點多態性對KD及KD并發CAL的影響，KD與其基因型及等位基因型患病的相對風險比用比值比(odds ratio，OR)和95%可信區間(confidence interval，CI)表示，其中OR值大于1表示該等位基因或基因型是一個危險因素，危險程度與OR值大小呈正比，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象一般情況

病例組：男性45例，女性30例，其中0～1歲25例(33.33%)，1～3歲41例(54.67%)，≥3歲9例(12.00%)，年齡為(1.80±1.26)歲。CAL組中男性21例，女性15例，平均年齡為(1.80±1.23)歲；NCAL組中有男性24例，女性15例，平均年齡為(1.79±1.32)歲。

對照組：年齡3月～6歲，其中0～1歲31例(41.33%)，1～3歲35例(46.67%)，≥3歲9例(12.00%)，男性40例，女性35例，年齡為1.78±1.33歲。兩組組間年齡和性別比例分布差異均無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 病例組與對照組MPO基因

rs2333227位點基因型分布及等位基因頻率分布的比較，病例組和對照組MPO基因rs2333227位點等位基因頻率分布差異無統計學意義(χ2=2.387，P=0.169)，GG、GA和AA基因型頻率分布差異無統計學意義(χ2=1.316，P=0.339)，詳見表1及表2。

表1 病例組和對照組MPO基因rs2333227位點的等位基因頻率[n(%)]

表2 病例組和對照組MPO基因rs2333227位點的相關性分析[n(%)]

2.3 MPO 基因多態性與KD 臨床特點的相關性

MPO基因rs2333227多態性與KD臨床特征的相關性分析結果表明，皮疹、唇及口腔表現、手足癥狀、球結膜充血、淋巴結腫大、WBC、中性粒細胞百分比、血沉、CRP及BNP在基因型GG和GA+AA組間差異無統計學意義(P＞0.05)，詳見表3及表4。

表3 MPO基因rs2333227多態性與KD臨床特征的相關性分析[n(%)]

表4 MPO基因rs2333227多態性與KD輔助檢查的相關性分析(±s)

表4 MPO基因rs2333227多態性與KD輔助檢查的相關性分析(±s)

GG(n=54) GA+AA(n=21) t P WBC(109/L) 15.19±5.60 16.47±6.32 0.625 0.521中性粒細胞百分比(%) 63.21±21.10 58.05±17.08 0.688 0.611血沉(mm/h) 62.40±24.10 64.20±28.00 0.172 0.812 CRP(mg/L) 75.15±40.07 54.15±30.19 1.372 0.192 BNP(pg/L) 862.50±390.85 500.61±218.60 1.767 0.069

2.4 CAL組和NCAL組 MPO基因 rs2333227位點基因型分布及等位基因頻率分布的比較

KD中CAL組和NCAL組的MPO基因rs2333227位點等位基因頻率分布具有統計學差異(χ2=6.055，P=0.015)，GG、GA和AA基因型頻率分布差異具有統計學意義(χ2=7.602，P=0.009)，詳見表5及表6。與GA和AA基因型相比，GG基因型增加CAL的發生風險(OR：4.65，95%CI：1.486-14.576)。

表5 KD中CAL組和NCAL組的MPO基因rs2333227位點的等位基因頻率[n(%)]

表6 KD中CAL組和NCAL組的MPO基因rs2333227位點的相關性分析[n(%)]

3 討論

KD的病因尚未明確，近些年來，越來越多的證據表明KD存在明顯的種族差異與地域區別，亞裔兒童及亞洲的發病率最高，說明遺傳因素可能是發揮了重要作用。其中，關于MPO基因的研究早在2001年因其與冠狀動脈疾病的關系較為顯著而受到重視。髓過氧化物酶(MPO)是過氧化物酶亞家族的成員，位于人第17號染色體q23區域，分子量為140 kDa，轉錄產物主要由11個內含子和12個外顯子組成，MPO作為白細胞分泌的一種酶，導致氧化過激，過度激活機體免疫應答系統，導致免疫功能紊亂，損傷內皮細胞，最終導致血管炎性改變，其中冠狀動脈的損傷較為多見，故MPO的任何異常表達和釋放都可能加重炎癥和組織的損傷[10]，大量研究證實MPO通過氧化參與血管炎癥的發生、發展，是血管炎癥的重要生物標志物之一[11]，對早期預警心血管疾病有重要作用。

SU等[12]為了確定MPO是否能識別和確認血管炎小鼠模型中血管壁炎癥的部位，在研究26只KD小鼠的過程中，使用血管磁共振成像成功識別了血管炎區域，證實了MPO是血管炎炎癥的生物標志物，進一步表明MPO在KD的發生發展中起著重要的作用。這些發現均表明，MPO可能在KD引起的炎癥中起重要作用。該位點主要存在于中性粒細胞的溶酶體中，產生高濃度的活性氧，可調控MPO基因的活性，進而過量產生ROS可引起DNA損傷[13]。Piedrafita FJ、Tang等[14-15]發現MPO基因rs2333227位點G等位基因的表達水平較A等位基因強。

近年來，臺灣人Weng KP、國內趙宗秀、熊志研究證實[5-7]，MPOrs2333227位點多態性與KD的易感關系較為密切，G的等位基因頻率顯著高于對照組。本研究結論該基因SNP與內蒙古中部地區漢族兒童的川崎病易感性無明顯相關性，結果不盡相同。趙宗秀(研究對象四川成都)認為MPO基因SNP位點多態性可能與KD患兒冠狀動脈損傷的發生有關，其中G等位基因可能是風險因子。熊志(研究對象湖北)顯示該SNP位點多態性與結膜充血、皮疹、冠狀動脈損傷肝臟腫大、脾臟腫大、小葉性肺炎等影像學特點無關，攜帶有GG基因型的患兒發生手足水腫、腹腔積液的比例較其他基因型患兒高。本研究中發現KD的典型臨床表現(如皮疹、唇及口腔表現、手足癥狀、球結膜充血、淋巴結腫大)中與MPO基因rs2333227位點的各基因型無明顯相關性，但攜帶GG基因型患兒增加CAL的發生風險。臨床表現及冠狀動脈損害之間的關系結果不完全相同，但均顯示GG基因型患兒為高風險因子。

關于基因與KD的易感性及其并發CAL的相關性在國內外近幾年已研究發現出多種基因，而目前關于單一致病基因對疾病發生的影響的相關研究可能較少，結合此次研究內蒙古中部地區漢族兒童，樣本例數少，實驗條件較為局限性，各種與氧化應激有關的生物標志物和中性粒細胞活化也未得到評估，且KD本身存在地區差異，MPO基因SNP rs2333227位點與KD的臨床表現及KD并發CAL的關系尚需大樣本、多中心的研究，建議進一步對獨立大群體進行復制研究。