YTHDF1對HBV蛋白表達和HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用

謝永麗，湯華

（天津醫科大學基礎醫學院病原生物學系，天津 300070）

肝細胞癌（HCC）是人類主要惡性腫瘤之一，死亡率排名全球第4位。而乙型肝炎病毒（HBV）感染是引發HCC的主要危險因素，占全球HCC病例的一半以上。因此，迫切需要更好地了解HBV導致HCC的分子機制以及找到新型治療靶點。N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中發生的最豐富的修飾。研究表明，m6A在病毒和疾病發生、發展過程中起重要作用。雖然YTHDF1（YTH N6-methyladenosine RNA-binding protein 1）已經被報道與卵巢癌抗癌免疫療法[1]和海馬依賴性學習及記憶[2]等有關，但其在HBV相關肝癌中的作用研究尚少。

本研究通過分子克隆機制構建了過表達和敲降YTHDF1質粒，探討YTHDF1對HBV編碼蛋白表達的影響和對HBsAg、HBeAg抗原分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人正常肝細胞L02、肝癌細胞系Huh7、HepG2.2.15細胞，均購買自ATCC細胞庫，并為本實驗室液氮保存。胎牛血清（FBS）、DMEM、MEM-α培養基、Opti-MEM培養基均購自美國GIBCO BRL。Lipofectamine2000購自Invitrogen。所有抗體、cDNA均購自中國天津賽爾生物。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養L02細胞、Huh7細胞用含有10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素以及100 IU/mL青霉素的DMEM培養基培養。HepG2.2.15細胞用含有15%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 IU/mL青霉素、2 mmol/L谷氨酰胺以及200 μg/mL G 418的MEM-α培養基培養。上述細胞均培養在含5%CO2、37℃的細胞培養箱中。

1.2.2 過表達YTHDF1質粒的構建 用YTHDF1 cDNA作為模板進行PCR，PCR循環體系如下：預變性95℃4 min；變性94℃1 min，退火55℃30 s，延伸72℃2 min，進行“變性-退火-延伸”循環33次；延伸72℃10 min。回收大小約為1.67 kb的PCR產物。對pCD3/Flag-KBE質粒和PCR產物進行酶切，酶切位點為BamHⅠ和XhoⅠ,回收大小約為5.6kb和1.67 kb酶切產物。然后連接，鋪板，小提鑒定，酶切位點為BamHⅠ和XhoⅠ，將條帶正確的質粒送測序。

1.2.3 敲降YTHDF1質粒的構建 首先針對YTHDF1 mRNA設計合成編碼shRNA的DNA單鏈，引物序列如表1，然后將其在95℃條件下退火5 min,室溫條件下靜置2 h，和用BamHⅠ和HindⅢ酶切好的pSilencer2.1-U6 neo質粒進行連接，鋪板，小提鑒定（酶切位點為EcoRⅠ和XhoⅠ）。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.4 轉染（脂質體法）在Huh7細胞中，將HBV蛋白質粒與pSilencer2.1-U6 neo、pshR-YTHDF1質粒共同轉染，每組兩個質粒分別各轉0.5 μg，將質粒和Lipofectamine2000按照1 μg：1 μL比例分別加入到無血清Opti-MEM培養基中，室溫靜置5 min，然后將Lipofectamine2000管加入到質粒管中，室溫靜置20 min，最后加入到細胞板中。轉染6 h換液，48 h收取蛋白樣品進行后續實驗。

1.2.5 ELISA實驗的轉染（脂質體法）在HepG2.2.15細胞中轉染過表達、敲降YTHDF1及其對照質粒。在Huh7細胞中轉染過表達、敲降YTHDF1及其對照質粒的同時，共同過表達pHBV1.3質粒，在L02細胞中轉染過表達YTHDF1及其對照質粒的同時，共同過表達pHBV1.3質粒，每孔質粒共1 μg。轉染方法同1.2.4。48、72 h分別收取600 μL上清進行后續實驗。

1.2.6 Western印跡實驗 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液收取蛋白樣品，加入5×loading buffer，100℃加熱5 min，然后冰置5 min。用10%SDS-PAGE膠分離蛋白（蛋白上樣量為30 μL），將蛋白轉移到PVDF膜上。室溫條件下用5%脫脂牛奶封閉2 h，裁剪PVDF膜，分別用相應的抗體孵育過夜。用TBST漂洗孵育一抗的PVDF膜，加入相應的二抗孵育2 h，再用TBST漂洗孵育二抗的PVDF膜，用Western LightningTM化學發光試劑作用2 min，然后進入暗室中用感光膠片曝光，等膠片完全晾干，分析結果并拍照。

1.2.7 ELISA檢測分泌HBsAg和HBeAg的抗原 根據ELISA試劑盒說明書操作。

1.3 統計學處理 實驗均重復3次，使用Image J軟件、Graph Pad Prism6.0軟件處理實驗數據，數據均表示±s，組間比較采用雙側Studentt檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Western印跡檢測YTHDF1的表達 如圖1所示，與正常肝細胞L02相比，HBV陰性肝癌細胞Huh7細胞和HBV陽性肝癌細胞HepG2.2.15細胞中YTHDF1的表達分別增加4倍和7倍，YTHDF1在HBV陽性肝癌細胞HepG2.2.15細胞中的表達是HBV陰性肝癌細胞Huh7細胞的1.5倍（t=17.4、39.6、8.4，均P＜0.05）。

圖1 Western印跡檢測YTHDF1在不同細胞中的表達Fig 1 The expression of YTHDF1 in different cells detected by western blotting assay

2.2 YTHDF1過表達質粒的構建 用YTHDF1 cDNA作為模板，YTHDF1-295-BamHI、YTHDF1-1971-XhoI作為上下游進行PCR，產生大小約為1.67 kb的條帶（圖2A）。對pCD3/Flag-KBE質粒和PCR產物進行酶切，產生大小為5.6 kb和1.67 kb的條帶（圖2B）。最后進行酶切鑒定，挑選同時有5.6 kb和1.67 kb兩條條帶的2號質粒送測序（圖2C）。將測序結果序列和NCBI序列比對。測序結果正確后，質粒轉染Huh7細胞后第3天，制備細胞裂解物，用Flag抗體進行檢測，確定了YTHDF1在細胞中表達（圖2D）。

圖2 pCD3/Flag-YTHDF1質粒的構建與鑒定Fig 2 Construction and validation ofplasmidpCD3/Flag-YTHDF1

2.3 YTHDF1敲降質粒的構建 將pSilencer2.1-U6 neo質粒進行酶切，產生大小為5.6 kb的條帶（圖3A），小提酶切鑒定挑選同時有大小為5.6 kb和0.37 kb兩條條帶的質粒10號送測序（圖3B）。測序結果與設計的引物比對，測序結果正確后，質粒轉染Huh7細胞后第3天，制備細胞裂解物，用YTHDF1抗體進行Western印跡實驗驗證pshR-YTHDF1質粒有效（圖3C）。

圖3 pshR-YTHDF1質粒的構建與鑒定Fig 3 Construction and identification of plasmid pshR-YTHDF1

2.4 敲降YTHDF1后HBV編碼蛋白的表達水平 首先驗證了HBV編碼蛋白質粒的有效性（圖4A），其次Western印跡檢測敲降YTHDF1后，HBV編碼蛋白表達水平的變化（圖4B）。結果顯示，敲降YTHDF1后，HBV基因組編碼HBc蛋白（t=9.5）、HBs蛋白（t=5.2）、preS1蛋白（t=25.7）、preS2蛋白（t=9.0）、HBx蛋白（t=19.7）、HBV DNA Pol蛋白（t=23.0）均降低（均P＜0.05）。

圖4 Western印跡檢測Huh7細胞中pshR-YTHDF1對HBV編碼蛋白的影響Fig 4 The effect of pshR-YTHDF1 on HBV-encoded proteins in Huh7 cell dctected by western blotting assay

2.5 ELISA檢測過表達和敲降YTHDF1對HBsAg和HBeAg抗原分泌的影響 與對照組相比，轉染pHBV1.3質粒組分泌的HBeAg抗原在48 h（t=118.4）和72 h（t=28.7）分別增加8倍和6倍（圖5A），差異均有統計學意義（均P＜0.01）。在Huh7細胞中，過表達YTHDF1時，HBsAg（t48h=5.5，t72h=5.0）和HBeAg抗原（t48h=5.7，t72h=6.3）表達水平增加，敲降YTHDF1時，HBsAg（t48h=16.0，t72h=7.9）和HBeAg抗原（t48h=9.0，t72h=14.3）表達水平降低（圖5B、C）。在HepG2.2.15細胞中，過表達YTHDF1時，HBsAg（t48h=5.3，t72h=27.4）和HBeAg抗原（t48h=29.0，t72h=6.6）表達水平增加，敲降YTHDF1時，HBsAg（t48h=22.3，t72h=7.0）和HBeAg抗原（t48h=8.1，t72h=6.6）表達水平降低（圖5D、E），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。而在正常肝細胞L02中過表達YTHDF1時，HBsAg（t48h=4.0，t72h=2.0）、HBeAg（t48h=3.5，t72h=1.8）抗原表達水平沒有增加，差異沒有統計學意義（圖5F、G）。

圖5 ELISA檢測HBsAg和HBeAg抗原的分泌Fig 5 ELISA for the detection of HBsAg and HBeAg antigen secretion

3 討論

HCC已成為全世界普遍存在的公共衛生問題。HBV是引起HCC的主要危險因素。HBV的當前治療方法包括干擾素和核苷酸類似物拉米夫定[3-4]、阿德福韋、恩替卡韋[5]、替比夫定、替諾福韋[6]以及最近獲得FDA批準的替諾福韋阿拉芬酰胺。核苷酸類似物進行抗HBV治療，可以有效抑制病毒的復制，但不能根除肝細胞核內的共價閉合環狀DNA（cccDNA）。然而，在不根除cccDNA的情況下，即使通過抗病毒治療實現了功能性治愈，HBV仍然繼續存在誘發肝癌發展的風險，特別是對于已經發展為肝硬化的患者[7]。治療性疫苗旨在通過引發新的抗病毒反應來增強免疫力，這些疫苗可能無法誘導功能性治愈，因為它們的效力不足以誘導HBV特異性T細胞。由于目前缺乏有效的干預措施，所以對HCC發生的分子機制的了解至關重要。

m6A可以調節細胞RNA生物學的許多方面[8-9]，這主要取決于m6A讀碼器[10]。多項研究指出，肝細胞損傷可能是由HBV復制和病毒產物的積累引起的[11]。而且HCC的發生與m6A RNA甲基化調節蛋白的異常表達有關[12-17]。此外，YTHDF1在調控HCC細胞的細胞周期和代謝方面也發揮著重要作用。因為已有文獻指出，YTHDF2和YTHDF3可以調節HBV的生命周期[18]，耗盡YTHDF2或YTHDF3會顯著增加HBs蛋白和HBc蛋白的表達。所以在這里筆者集中研究YTHDF1對HBV的影響，其中包括HBV編碼的蛋白水平和細胞分泌的抗原表達水平。

本研究中，筆者確定YTHDF1在肝癌細胞中高表達。然后構建了過表達和敲降YTHDF1質粒。HBV編碼的蛋白中HBc蛋白和HBs蛋白分別構成病毒衣殼和包膜，HBV DNA Pol蛋白在體內和體外都促進肝癌細胞的遷移、侵襲能力，HBx不構成病毒體的一部分，起轉錄反式激活的作用。HBV病毒蛋白可以影響病毒和宿主基因的表達。所以筆者首先研究YTHDF1對HBV病毒蛋白的影響。敲降YTHDF1后，HBV基因組編碼的蛋白表達降低。HBsAg表明機體被病毒感染，HBeAg表明病毒的傳染性、病毒的復制和肝臟損害程度。當HBsAg和HBeAg同時表達時表明感染嚴重。所以本實驗證明YTHDF1促進了HBsAg和HBeAg抗原的分泌。而在低表達的L02細胞中，過表達YTHDF1對HBsAg和HBeAg抗原的分泌沒有影響。

綜上所述，YTHDF1在肝癌細胞中可以促進HBV編碼蛋白的表達和HBsAg、HBeAg抗原分泌，所以YTHDF1可能在HBV感染中起重要作用。由于其對HBV DNA Pol蛋白表達的影響最大，所以后續的研究可能是YTHDF1影響HBV DNA Pol蛋白表達的具體分子機制。本研究為闡明m6A修飾調節HBV編碼蛋白的表達提供新理論依據，也具有潛在的臨床應用意義。