中國宮頸癌DNA甲基化標志物的研究進展

趙敬，楊金豪綜述，常艷敏，王蓉審校

（1.天津醫科大學總醫院婦產科，天津 300052；天津醫科大學醫學檢驗學院，天津 300203；天津市南開醫院檢驗科，天津 300100）

我國每年宮頸癌新發病例數為13.3萬以上，其中約有2萬～3萬死亡病例，且近年來我國年輕婦女宮頸癌的發病率、死亡率均呈上升趨勢[1]。目前研究證實宮頸癌的發生、發展與DNA甲基化相關[2]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶（DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為底物，將其提供的甲基基團加在胞嘧啶的第5位碳原子上，發生甲基化修飾，基于GC配對的機制，mCpG會在雙鏈中對稱出現。DNA甲基化對于基因的表達有重要的調節作用[3]。某些抑癌基因的啟動子區域發生甲基化，可降低其轉錄活性，使抑癌基因表達沉默，導致細胞增殖異常而產生惡性腫瘤。隨著對甲基化認識的不斷深入，研究者發現基因啟動子區異常甲基化是腫瘤發生的一個早期事件，是腫瘤早期診斷的非常有效的分子標志。此外，在腫瘤的發展過程中，DNA甲基化的動態改變還可以反映腫瘤的嚴重程度分級、侵襲轉移及提示患者的預后。然而，由于種族，生存環境的不同，各國報道的宮頸癌DNA甲基化標志物差異顯著。因此，本文對在中國婦女群體進行實驗驗證的宮頸癌DNA甲基化標志物做一總結分析，以期對后續的研究有所幫助。

1 宮頸癌高甲基化標志物

細胞信號轉導通路的異常往往影響細胞增殖和分化的正常調控，導致腫瘤的發生。因此可以把信號途徑相關的甲基化基因作為宮頸癌治療的重要靶點，通過對細胞信號途徑的干預，調整靶基因表達，使其恢復正常，以達到抑制腫瘤生長，治療腫瘤的目的。從我國近幾年報道的宮頸癌甲基化基因的生物學功能來看，主要集中在p53通路、凋亡相關、DNA修復、Ras信號通路、細胞循環(細胞周期)、細胞黏附、轉移和侵襲、Wnt通路等與癌癥發生、發展相關的信號通路。

1.1 DNA修復DNA修復是細胞對其DNA受損傷后的一種反應。MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶)是一種高效的DNA直接修復酶，能修復DNA序列中的6氧甲基鳥嘌呤的損傷，是人類細胞中迄今發現的唯一一種修復該損傷的甲基轉移酶。簡生燕等[4]研究顯示，宮頸癌組織MGMT甲基化率可達71.15%；且與組織分化程度呈負相關，并影響其基因的mRNA的表達。

1.2 細胞周期p16（INK4A）是周期依賴性激酶抑制因子，人類許多腫瘤存在p16基因和蛋白的改變。在宮頸癌組織中p16甲基化率（26%）顯著高于癌旁正常組織，且隨病變程度加重呈現升高趨勢。此外，p16基因啟動子甲基化與宮頸癌的臨床病理特征有關聯，甲基化更多發生在年齡小于40歲、低分化的宮頸鱗癌患者；p16甲基化的發生是獨立于HPV感染的事件，它們在宮頸癌的致病過程中有可能是選擇性的作用于不同的時期。

FHIT基因屬于組氨酸家族，吳慶華[5]首次在宮頸癌組織中揭示了FHIT基因5′端CpG島甲基化及其與基因失活的相關性。同期，史惠蓉等[6]又對宮頸癌及正常宮頸組織標本進行了檢測,結果宮頸癌標本中40%出現FHIT基因甲基化而正常宮頸上皮標本中未發現。任力群等[7]亦發現FHIT甲基化在宮頸癌組織（56.7%）中顯著高于宮頸上皮內瘤樣變（CIN）組（14.3%）及慢性宮頸炎組（0）。鑒于FHIT甲基化在腫瘤組織的顯著性，研究者們期待將其轉化為臨床可應用的腫瘤標志物，對臨床獲取血清樣本的檢測發現，血漿FHIT甲基化的發生率與組織具有良好的相關性[8-9]。

SEPT9基因是GTP結合蛋白家族成員，參與細胞骨架的形成、細胞分裂和腫瘤的發生等。其基因啟動子的高甲基化已經做為大腸癌的標志物，最近研究顯示其亦可促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉移，影響細胞周期的調控。其基因的甲基化對宮頸癌的診斷也具有良好的敏感性和特異性（AUC=0.854，P<0.001）[10]。

1.3 細胞凋亡 相關蛋白激酶1（DAPK1）是細胞凋亡正調控因子，是一種抑癌基因。我國Yang等[11]發現在60%宮頸癌組織、40%宮頸癌患者血漿中DAPK1啟動子區存在異常甲基化。而且還發現DAPK1基因啟動子區甲基化的程度與臨床病理學分級相關，且對于鱗癌細胞的檢出更敏感[12]。花敏慧[13]也得出了DAPK1甲基化在篩查宮頸癌和癌前病變的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為46.43%、97.92%、96.30%和61.04%。

1.4 細胞黏附、轉移和侵襲CDH1基因編碼E-鈣黏蛋白，屬于細胞黏附分子家族，介導相鄰的上皮細胞間依賴鈣的細胞連接，對于維持細胞分化、極性和正常組織結構起重要作用。Chen等[14]發現在75%的宮頸癌組織中CDH1蛋白表達缺失，且40%的宮頸癌組織中呈現高甲基化，此外，CDH1基因高甲基化與DNMT1的增加相關。Ren等[15]研究了宮頸癌血清樣本與組織標本一致率達76.66%。陳勇等[16]還發現CDH1基因甲基化率與臨床病理特征相關。其甲基化率鱗癌組比腺癌組高，隨腫塊增大及FIGO分期升高而增高。

研究發現CADM1/TSLC1（細胞黏附分子1）在宮頸癌組織中異常甲基化率達66.2%，其中鱗癌67.8%，腺癌55.5%，宮頸上皮內瘤變組織43.3%。此外，hrHPV感染的CIN 2/3到宮頸癌的演進過程中經常發現由于啟動子甲基化引起的CADM1基因表達沉默，但是CADM1/TSLC1 mRNA在非瘤性HPV永生化細胞株中表達豐富，提示CADM1/TSLC1基因表達沉默可能與HPV永生化到致瘤性表型的轉化有關[17]。

EZRIN蛋白編碼細胞質外周膜蛋白，主要是微絨毛的蛋白酪氨酸激酶底物作為ERM蛋白家族的一員，該蛋白主要在質膜和肌動蛋白細胞骨架之間起作用。其在細胞表面的黏附、遷移和組織中起著關鍵作用，并與多種人類癌癥有關。

1.5 Ras信號通路 宮頸癌組織中RASSF1A基因的甲基化首先是在小細胞肺癌組織中被發現的，常處于失活狀態。最近也有研究顯示，RASSF1A基因在宮頸癌組織甲基化陽性率為35%，其甲基化率隨著臨床分期呈逐漸升高趨勢。同時，宮頸鱗癌的RASSF1A基因甲基化率明顯高于宮頸腺癌，但RASSF1A基因甲基化與宮頸癌的組織學分級和淋巴結轉移無關[18]。

1.6 Wnt信號通路 正常的APC蛋白與Axin、Gsk-3β形成復合物可降解β-catenin，保證Wnt信號途徑對細胞特化、增殖以及遷移的正常調節[19]。APC基因表達異常使游離β-catenin增多，引起基因不正常表達，將導致細胞黏附、生長、分化等方面的重要改變，使細胞發生癌變。宋銀宏和張昌菊[20]研究發現APC啟動子區CpG島在Hela細胞中全甲基化，在Siha細胞中無甲基化。

SFRP1是Wnt信號通路的負調控因子，主要與FZ受體競爭結合Wnt蛋白，阻斷Wnt信號的轉導，調節細胞的增殖、凋亡。胡丹尼等[21]探討了SFRP1基因啟動子區甲基化與宮頸癌進展的相關性。結果顯示，甲基化率大于80%的CpG多分布于CIN2/3和宮頸癌組織之中。Chung等[22]研究也證實SFRP1基因高甲基化與宮頸癌的進展相關。

1.7 轉錄因子SOX家族基因參與性別決定、骨組織發育、血細胞形成、神經系統發育及晶狀體發育等多種組織器官的發育過程。目前，SOX1和SOX9甲基化與宮頸癌的關系在我國已有報道。張秀茹等[23]報道了宮頸癌組織中SOX1 CpG島的甲基化率大于50%，且與正常對照差異有統計學意義。巫劍紅等[24]則鑒定了SOX9基因的甲基化，發現宮頸癌組平均甲基化分值高于正常宮頸組，鱗癌高于腺癌，G3高于G1/G2，有淋巴結轉移和脈管癌栓的高于無淋巴結轉移和脈管癌栓的。

PAX1也是一種重要的轉錄因子，參與骨骼發育形成。Pax1的基因突變會導致嚴重的脊柱缺陷。分別采用MSP、QMSP和測序等多種方法對宮頸癌及宮頸癌前病變的PAX1甲基化率進行了檢測和臨床評價，結果顯示Pax1基因甲基化率顯著高于正常組織，且隨著病變加重而增高，可應用于臨床宮頸癌的篩查。

2 HPV基因組的DNA甲基化

DNA甲基化也可以調節HPV的基因表達。胡元晶[25]對HPV16 L1基因3′端和LCR基因進行了測序。結果位于E6/E7啟動子的5個位點存在隨病情進展甲基化水平逐漸降低的趨勢，宮頸癌組患者的甲基化水平最低。位于L1基因3′端的3個位點的甲基化水平在攜帶組、CIN組與宮頸癌組患者間比較有差異。由此推斷，HPV16甲基化狀況可能預測宮頸癌癌前病變或宮頸癌的發生。

3 地區及種族特異性報道的甲基化基因

新疆是我國宮頸癌高發區之一，維吾爾族婦女宮頸癌患病率，病死率在全國少數民族中占第1位[26]。目前，報道過的和宮頸癌發生相關的甲基化基因包括DAPKTFPI-2CALCACADM1、SFRP1、P16、MDR1、CCNA1、APM、EGFR、hRFT2、IFITM1和HS3ST2等，與新疆維吾爾族婦女宮頸癌的發生、發展密切相關。瑪依拉·卡米力江等[27]認為RAR基因高甲基化是維吾爾族宮頸癌演進過程中的重要標志。

此外，除了中國大陸，中國臺灣地區關于宮頸癌甲基化標志物的研究也方興未艾。其中，LAI等[28-29]研究發現宮頸癌DNA甲基化基因包括SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和ONECUT1等。近期研究顯示LMX1A、NKX6-1、PAX1、PTPRR、SOX1和ZNF582也是宮頸腺癌中出現的高甲基化基因[30]。

4 宮頸癌低甲基化標志物

基因啟動子區異常甲基化是腫瘤發生的一個早期事件，是腫瘤早期診斷的非常有效的分子標志。然而，目前大多數研究集中在高甲基化基因，而低甲基化基因報道較少。有報道STK31基因在HPV16/18陽性宮頸癌細胞系中，其啟動子/外顯子1呈現低甲基化，從而誘導HPV16E7/E6的整合[31]。也有報道長鏈非編碼RNA（lncRNA）SOX21-AS1低甲基化在宮頸癌中有著臨床預后價值，lncRNA SOX21-AS1在宮頸癌中參與的生物過程如表皮發展、脫皮周期、皮膚表皮及分子功能等，lncRNA SOX21-AS1作為一種腫瘤抑制因子，是一種良好的宮頸癌預后指標[32]。

5 小結

DNA甲基化腫瘤標志物由于其樣本來源廣泛，檢測方法簡便穩定，并且可以實現高通量檢測，易于臨床轉化等優點，而日益成為研究熱點。每年，歐美國家都有一些宮頸癌相關的新的甲基化標志物不斷涌現，如荷蘭報道6個標志物的聯合檢測法(ASCL1、LHX8、ST6GALNAC5、GHSR、SST、ZIC1)[33]。同時，歐美國家在積極推進宮頸癌甲基化標志物的臨床轉化。目前，荷蘭、德國已經推出了商業化的宮頸癌甲基化的檢測試劑盒，包括PreCursor-M?，QIAsureMethylation Test?，GynTect，Oncgnostics?等[34]。相對于世界的研究水平，我國宮頸癌DNA甲基化的研究相對滯后很多，首先，缺少具有獨立知識產權的、針對中國婦女群體的宮頸癌甲基化標志物；其次，目標分散，缺少系統的大樣本群研究；再次，嚴重缺乏臨床轉化研究，缺乏在特殊人群如孕婦、人類免疫缺陷病毒感染患者群體的評價等，缺少對自檢樣本的檢測結果的評價，缺少隨訪研究等。最后，DNA甲基化標志物要想真正進入臨床，還需在方法學上進行改善優化，開發即時檢驗（POCT）產品；而持續深入研究這些甲基化基因的功能也是必不可少的；當然，深入調查啟動子低甲基化的基因亦是未來的重要研究方向之一。