基于UPLC-MS方法的品質易逝期活品蝦夷扇貝代謝組學研究

徐曇燁，田元勇，李亞烜，劉俊榮

(大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連116023)

蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis是中國重要的貝類經濟養殖品種之一，據統計，2019年中國養殖貝類產量達1 457萬t[1]?；钇肺r夷扇貝作為一種高端海產品，其品質一直備受關注，對捕后活品蝦夷扇貝品質評價模式與變化機制的探究有助于提升產品品質，促進貝類產業發展。從海上采捕至陸基加工凈化前為貝類的品質易逝期(quality determination period, QDP)，根據本團隊多年的調研與實踐發現，該階段的環境變化及處置方式對于后續活品貝類的品質貯藏穩定性具有十分重要的影響，且存在明顯的延遲效應[2-3]。因此，有必要對品質易逝期蝦夷扇貝活品的代謝特征與品質變化進行探究。

扇貝的風味品質與其生理狀態密切相關，在活品貝類市場，扇貝開口率、閉合靈敏度及外套膜縮邊等常常能夠反映扇貝質量的好壞[4]。生化指標如pH、糖原、ATP關聯物、K值等也被廣泛用于貝類活力的評價[5-6]。此外，游離氨基酸、水溶性蛋白及免疫因子等亦可作為扇貝品質評價指標[7-9]。然而，這些傳統的感官評價或單一理化指標往往靈敏度不夠、品種針對性不強。目前，尚缺乏分子水平上蝦夷扇貝代謝特征的全面分析。

代謝組學(metabolomics)是考察生物細胞、組織、器官或者生物體在不同狀態下小分子物質種類、數量及其變化規律的科學[10]。其主要研究手段包括核磁共振譜(NMR)、氣相色譜-質譜(GC-MS)和液相色譜-質譜(LC-MS)等方法[11]，其中，超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)具有靈敏度高、選擇性好、信息豐富等優點，被廣泛應用于代謝組學研究中[12]。多元統計分析方法用于代謝組學的數據降維與信息挖掘，主要包括無監督的主成分分析法(PCA)與有監督的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)等[13]。近年來，代謝組學作為一種行之有效的方法應用于水產品的生理變化研究，如Pilditch等[14]研究了溫度波動和食物供應對幼齡海扇貝Placopectenmagellanicus生長和代謝的影響；Chen等[15]運用代謝組學方法研究了半無水保存期間櫛孔扇貝Chlamysfarreri的生理變化；Rochfort等[16]發現代謝組學方法可能有助于確定貽貝的產地；劉佳琳等[17]研究了褐牙鲆Paralichthysolivaceus幼魚全組織在低鹽脅迫后的代謝組變化。

本研究中，以蝦夷扇貝為研究對象，利用UPLC-MS代謝組學技術，將捕后早期設定為36 h之內，分析了品質易逝期濕藏條件下蝦夷扇貝閉殼肌的差異代謝物及代謝途徑，探索了濕藏條件下活品蝦夷扇貝的代謝模式，以期為活品貝類代謝組數據的準確分析提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用蝦夷扇貝于2019年12月購自大連市長興水產品市場，殼高為(11.37±0.30)cm，殼長為(11.01±0.31)cm，殼寬為(2.27±0.08)cm，均為當日到貨，采用泡沫箱密封(碎冰降溫)，于1 h內運至實驗室，立即進行分選和貯藏處理，剔除活力弱或死亡的蝦夷扇貝。試驗在遼寧省水產設施養殖與裝備技術工程研究中心循環海水系統中進行。

儀器設備：精密電子天平(BS224S型，北京賽多利斯儀器系統有限公司)；離心機(Z326K型，德國HERMLE Labortechnik GmbH公司)；超高壓液相色譜儀(Agilent 1290 Infinity LC，美國Agilent公司)；質譜儀(Triple TOF 5600，美國AB SCIEX公司)；Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱(美國Waters公司)；PH計(PB-10，德國Sartori-us公司)；水純化系統(Milli-Q，美國Millipore公司)。

試劑：乙腈、甲醇、氨水為色譜級(德國Merck公司)；乙酸銨為色譜級(德國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計及采樣處理 運抵至實驗室的蝦夷扇貝活體原料處于急驟應激狀態，立即置于循環海水系統中進行24 h緩沖，循環海水為經3次沉淀的自然海水，海水體積為0.91 m3，溶解氧質量濃度為6.3 mg/L，溫度為6.9 ℃。緩沖后的扇貝作為模擬捕后的初始狀態，即濕藏0 h，設為對照組(A)；在海水中繼續濕藏36 h，可看作蝦夷扇貝品質易逝期階段，設為濕藏組(C)。每組取10只扇貝用于代謝組學分析。此外，分別于濕藏0、3、6、12、24、36 h，從各組每個時間點取3只扇貝用于pH和糖原含量分析。

活貝樣品經手工開殼，將閉殼肌與其他軟體組織分離，取閉殼肌中心部位肌肉，立即用液氮處理后于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 生化指標的測定 參考田元勇等[18]的方法。試驗設3個重復，每只扇貝取2.0 g蝦夷扇貝閉殼肌，加入濃度20 mmol/L的碘乙酸鈉10 mL，冰浴下用玻璃棒搗碎，靜置25 min，冰浴條件下測定閉殼肌pH。

參考劉慧慧等[19]的方法。試驗設3個重復，每只扇貝取2.0 g 閉殼肌，加入質量分數30%的氫氧化鉀溶液，沸水浴中加熱20 min，冷卻后加入20 mL 無水乙醇，并在3 000g條件下離心15 min，取沉淀。采用蒽酮比色法于620 nm下測定吸光度，計算葡萄糖含量，糖原含量為葡萄糖含量的1.11倍。

1.2.3 代謝組學分析

1)樣品處理。試驗設10個重復,每只扇貝樣品取100 mg閉殼肌，在液氮下研磨后，加入800 μL甲醇-乙腈-水(體積比為2∶2∶1)渦旋混勻，4 ℃下超聲2次，每次30 min，然后在-20 ℃下孵育1 h沉淀蛋白質，4 ℃、13 000g條件下離心15 min，取上清液凍干后于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。質譜分析時加入100 μL乙腈水溶液(乙腈與水的體積比為1∶1)復溶，4 ℃下渦旋振蕩，以14 000g離心15 min，取上清液進行分析。為了對本次試驗進行質量控制，制備了所有樣品等量混合的樣本(QC樣本)，用于平衡色譜-質譜系統及測定儀器狀態，并用于整個試驗過程中系統穩定性的評價。

2)LC-MS/MS分析。

色譜分離：色譜流動相A為水+25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水，流動相B為乙腈，色譜梯度洗脫程序如表1所示。整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中，進樣量為10 μL，Waters Acquity BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱，柱溫為25 ℃，流速為 0.3 mL/min；樣本隊列中插入 QC 樣品，用于監測和評價系統的穩定性及試驗數據的可靠性。

質譜采集：采用電噴霧電離(ESI)進行正離子和負離子模式檢測。條件如下：干燥氣為60，輔助加熱氣為60，氣簾氣為30，毛細管溫度為600 ℃，離子噴霧空載電壓為±5 500 V；掃描范圍為60 000～1 200 000(相對分子質量)，掃描積累時間為0.15 s；二級質譜采用高靈敏度模式，掃描范圍為25 000～1 200 000(相對分子質量)，掃描積累時間為0.03 s，去簇電壓為±60 V，碰撞能量為30 eV，IDA模式，同位素排除4 000之內，離子監測周期6。

1.3 數據處理

UPLC-MS分析的原始數據經ProteoWizard轉換成.mzXML格式，然后采用XCMS程序進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。對XCMS提取得到的數據，刪除組內缺失值>50%的離子峰，應用軟件SIMCA-P 14.1(Umetrics，Umea，Sweden)進行模式識別，數據經Pareto-scaling預處理后，進行多元統計分析，包括無監督的主成分分析(PCA)及有監督的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)等。代謝物結構鑒定通過峰的保留時間、精確質量數匹配(<25×10-6)和MS/MS二級譜圖匹配的方式，檢索實驗室數據庫進一步確認代謝物。代謝通路解析通過代謝通路數據庫KEGG Pathways(KEGG,www.genome.jp/kegg)進行。

2 結果與分析

2.1 pH及糖原含量

從圖1可見，品質易逝期濕藏條件下活品蝦夷扇貝閉殼肌的pH變化不大，為7.29～7.38，糖原也維持在較高水平，為25.5～31.3 mg/g，說明扇貝狀態較好，品質較高。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 代謝組學分析

2.2.1 多元統計分析 通過LC-MS/MS質譜檢測，正離子模式下共獲得了8 844個峰，在負離子模式下共獲得了8 692個峰。將QC樣本正、負離子檢測模式下的質譜總離子流圖(TIC)分別進行譜圖疊加比較，各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊(圖2(a)、(b))；將所有試驗樣本和QC樣本提取得到的峰，經Pareto-scaling處理后進行PCA分析，經7次循環交互驗證得到PCA模型，圖中的QC樣品緊密聚集，說明整個試驗過程中儀器誤差引起的變異較小，試驗數據可靠(圖2(c)、(d))。

圖2 QC樣本的TIC重疊圖譜與A、C和QC樣本的PCA得分圖

去除QC樣本，將對照組(A)與濕藏組(C)的樣品進行PCA分析，結果顯示，正負離子模式下，所有樣本均出現在HotellingT295%置信區間的橢圓內，說明兩組樣本不存在異常值(圖3)，然而在PCA下組間樣本并無良好的區分。采用有監督的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)對兩組樣本進行進一步分析。結果顯示，在兩種模式下，蝦夷扇貝A、C樣本均發生組內聚集且組間分離趨勢，且在OPLS-DA模式下該趨勢更加明顯(圖4(a)、(c)和圖5(a)、(c))，這說明海水濕藏36 h后蝦夷扇貝的代謝模式發生改變。

圖3 A組和C組樣本的PCA得分圖

表2 PLS-DA與OPLS-DA模型的評價參數

圖4 A組和C組的PLS-DA得分圖和置換檢驗圖

圖5 A組和C組的OPLS-DA得分圖和置換檢驗圖

2.2.2 差異代謝物的鑒定與通路分析 根據OPLS-DA 模型得到的變量權重值(variable importance for the projection, VIP)來衡量各代謝物的表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，挖掘具有生物學意義的差異代謝物。本試驗中，以VIP>1作為篩選標準，同時結合單變量分析方法差異倍數分析(fold change analysis，FC)和Student’sT，檢驗顯示兩組樣本間代謝物變化的顯著性，以 FC>2 或 FC<0.5 且P<0.05 作為篩選標準，共篩選出7個顯著性差異的代謝物(表3)，包括二十二烷酸(behenic acid)、酪胺(tyramine)、脯氨酰谷氨酸(prolyl-glutamate)、二磷酸腺苷葡萄糖(ADP-glucose)、尿苷5-二磷酸(uridine 5′-diphosphate, UDP)、3-磷酸絲氨酸(3-phosphoserine)和檸檬酸(citrate)。

各差異代謝物濕藏后的變化趨勢如圖6所示，其中，3-磷酸絲氨酸發生上調，其余6個差異代謝物則為下調。KEGG通路分析表明，三羧酸循環(TCA cycle)是最容易受到影響的代謝通路(圖7)。

圖6 對照組(A)和濕藏組(C)顯著性差異代謝物熱圖

圖7 差異代謝物的通路富集分析

3 討論

3.1 代謝組學技術用于貝類活品品質評價方法的構建

扇貝作為活體生物，其生理代謝活動會隨著環境影響發生變化，因此，扇貝的生理代謝及活力狀態可以一定程度上反映扇貝的品質。pH和糖原是反映貝類生理狀態的重要指標之一。糖原是扇貝主要的儲能物質，也是扇貝重要的呈味物質[22]。傳統的評價方法如pH、糖原等，都是以單一指標作為響應值。代謝組學是以組群指標分析為基礎，針對生物樣本內所有小分子代謝物進行分析，目的是從海量數據中發現潛在標志物。與傳統生化指標相比，代謝組學技術更為全面靈敏。代謝組學數據處理通常采用PLS-DA或OPLS-DA進行多元統計分析。選取合適的模型有助于提高數據分析的準確性。OPLS-DA較PLS-DA增加了一個正交換算，可以把與模型分類不相干的信號過濾掉，因此，OPLS-DA解釋能力更強，可更準確地篩選出組間差異[23]。相較于PLS-DA，OPLS-DA分析可以更好地避免過擬合現象，但與PLS-DA相比通常無預測性能的提升。本研究結果證明了這一點。

3.2 品質易逝期濕藏條件下活品蝦夷扇貝的代謝特征

本研究表明，品質易逝期濕藏36 h活品蝦夷扇貝閉殼肌中pH和糖原含量有所波動，但變化不大，兩者的波動范圍可說明此條件下扇貝狀態良好，其中，糖原含量的變化相比于pH較明顯。扇貝體內pH的改變通常與其代謝產物有關，乳酸、丙酮酸等無氧代謝產物的升高均可導致扇貝體內pH的降低[24]。品質易逝期濕藏的蝦夷扇貝閉殼肌pH并無明顯下降，這說明扇貝體內無氧代謝產物并未積累，而糖原含量波動則說明能量代謝途徑的活躍。在代謝組學分析中，蝦夷扇貝濕藏36 h后與初始扇貝的代謝存在差異，通過OPLS-DA分析篩選了7個顯著差異代謝物，即2個氨基酸、2個有機酸、2個核苷酸和1個胺類物質。貝類中廣泛存在著氨基酸、核苷酸等非揮發性含氮呈味物質[25]，游離氨基酸被認為在新陳代謝中起重要作用，參與蛋白質的構建、滲透調節[26]及免疫反應[27]。在濕藏條件下，3-磷酸絲氨酸出現明顯的上調趨勢。根據KEGG代謝通路顯示，該物質參與了甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等多種游離氨基酸的代謝，與氨基酸的合成密切相關。另有報道，肌球蛋白的調節功能可能與3-磷酸絲氨酸有關[28]。此外，酪胺和脯氨酰谷氨酸同樣參與了氨基酸代謝。Aru等[29]對貽貝Mytilusgalloprovincialis冰藏期間的NMR代謝組學分析顯示，丙氨酸含量有降低；Chen等[15]對覆蓋潮濕無紡紙的活扇貝Chlamysfarreri的GC-MS代謝組學分析顯示，谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸含量有降低。以上研究說明，氨基酸物質的調節對于維持貝類生命代謝較為重要。此外，能量物質往往能夠最直接地反映扇貝的生理狀態。捕后早期濕藏條件下蝦夷扇貝有氧呼吸代謝活躍，本研究中發現三羧酸循環通路的過程產物——檸檬酸出現下調趨勢。能量代謝涉及高能磷酸鹽的降解與合成[4, 30]，本研究中二磷酸腺苷葡萄糖和尿苷5′-二磷酸的下調可能與該過程有關。二十二烷酸是一種脂肪酸類物質，它的前體物質為behenoyl-CoA，因此，二十二烷酸的減少也在一定程度上反映了能量物質的波動。這表明，三羧酸循環是最易受到影響的代謝通路。以上結果顯示，品質易逝期濕藏條件下活品扇貝的有氧呼吸作用顯著，與能量有關的代謝是最主要的代謝途徑。

綜上，傳統的品質評價指標pH及糖原并不靈敏，代謝組學分析方法可以較為靈敏、全面地反映品質易逝期活品蝦夷扇貝濕藏條件下的實時狀態，這對探索高端貝類產品品質評價及變化機制具有較為重要的意義。

4 結論

本研究中以蝦夷扇貝為研究對象，通過超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)法對其代謝組學進行分析，從分子層面探索了品質易逝期海水濕藏36 h活品蝦夷扇貝的代謝特征。

1)本研究中詳細描述了從數據采集、數據集預處理、模式識別到篩選差異代謝物的過程，通過OPLS-DA方法建立的模型表明，蝦夷扇貝濕藏36 h后與初始扇貝的代謝存在顯著差異。

2)經過篩選和鑒別，共發現7個顯著差異代謝物，且三羧酸循環通路是最易受影響的代謝通路。品質易逝期濕藏條件下活品扇貝有氧呼吸作用顯著，與能量有關的代謝是最主要的代謝途徑。

3)代謝組學是一種較為靈敏的技術手段，可以用于貝類活品品質評價與變化機制的研究。本研究為活品貝類代謝組數據的分析方法與操作流程提供了參考依據，也為今后研究貝類的活力評價與品質調控提供了新的思路和方法。