水產動物致病酵母菌研究進展

申洪彬，包杰，姜宏波

(沈陽農業大學 畜牧獸醫學院，遼寧 沈陽 110866)

酵母菌是一類單細胞真核生物，廣泛分布于自然界中,其細胞大多呈卵圓形、球形等，具有細胞壁、線粒體、細胞核等較為復雜的真核細胞結構，是較為高等的單細胞真核微生物。酵母菌不具備運動功能，其生長溫度為0～47 ℃，pH為 3.0～7.5，最適生長溫度為15～28 ℃，最適pH為4～6[1]。目前，已發現1 000多種酵母菌，其中大部分為有益菌，常應用于多種工業過程中，如酒精發酵、面包烘焙、食物或飼料，以及各種代謝產物的生產中[2-3]。而有些酵母菌則具有致病性，給人類和動植物的健康造成了威脅，如寄生在人體皮膚黏膜的新生隱球酵母菌Cryptococcusneoformans和白色假絲酵母菌Candidaalbicans等。已經發現的水產動物致病酵母菌種類不多，但分布廣泛，可以侵染多種水產經濟物種，在近幾年水產養殖中發病率逐漸增高，且因尚無特效藥物，導致該病治療困難，造成了極大的經濟損失，嚴重影響了水產養殖產業的健康發展[4]。

本研究中，主要對水產動物致病酵母菌的種類、主要危害、流行情況、傳播途徑、檢測方法和防治技術等方面的研究進展進行了綜述，以期為水產動物致病酵母菌的防治和科學研究提供參考。

1 水產動物致病酵母菌的種類、感染宿主及主要癥狀

水產動物致病酵母菌主要分為擔子菌和子囊菌兩大類，可侵染多種水產養殖經濟物種。目前，發現的水產動物致病酵母菌有梅奇酵母屬Metschnikowia、隱球菌屬Cryptococcus、假絲酵母屬Candida、畢赤酵母屬Pichia、內孢酵母屬Endomyces、德巴酵母屬Debaryomyces和球擬酵母屬Torulopsis等[5-17]。這些酵母菌可獨自或與其他病原菌共侵染羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii[7,9]、中華絨螯蟹Eriocheirsinensis[5-6]、三疣梭子蟹Portunustrituberculatus[8,10-12]、大鱗大麻哈魚Oncorhynchustshawytscha[15]、天鵝絨蟹Necorapuber[16]及歐洲食用蟹Cancerpagurus[17]等多種水產經濟動物。葡萄牙假絲酵母Candidalusitaniae為子囊菌類的假絲酵母，其規格為(1.3～6.5)μm×(2.3～7.8)μm，大多呈卵圓形，出芽生殖[10-12]，具有假菌絲形態，能夠侵染三疣梭子蟹等水生動物[8]；莫格球擬酵母菌Torulopsismogii屬于擔子菌類的隱球菌，其規格為(2.5～5.0)μm×(3.75～6.25)μm，大多呈卵圓形，菌體表面有莢膜，多邊芽殖[9,18]，其形態可在酵母狀細胞到菌絲狀細胞間轉變，進而侵染羅氏沼蝦等水生動物宿主[7,9,19-20]。水產動物致病酵母菌還可與其他病原菌協同侵染寄主，如二尖梅奇酵母Metschnikowiabicuspidata與屎腸球菌Enterococcusfaecium共侵染羅氏沼蝦，使其患病甚至死亡[13-14]。有些酵母菌與血卵渦鞭蟲Hematodiniumsp.共侵染歐洲食用蟹或天鵝絨蟹[16-17]。

致病酵母菌侵染水產動物后，酵母菌會在患病動物各組織中大量增殖，并引起組織發生以壞死為主的變質性病變，其病理特征主要表現為細胞變性、壞死，細胞核碎裂、崩解，嚴重時會導致機體死亡。因致病酵母種類不同及宿主的差異，常導致各種水產動物的患病癥狀存在明顯差異。如感染葡萄牙假絲酵母的梭子蟹和感染二尖梅奇酵母的中華絨螯蟹血液均會出現嚴重乳化現象[5-6,8]；而感染莫格球擬酵母Torulopsismogii的羅氏沼蝦和感染二尖梅奇酵母Debaryomyceshansenii的大鱗大麻哈魚則無明顯的外部臨床癥狀[9,15,18]；羅氏沼蝦感染二尖梅奇酵母和漢斯德巴氏酵母Debaryomyceshansenii后則會表現出明顯的外部臨床癥狀[7](表1)。

表1 水產動物致病酵母菌種類及其引起的水產動物癥狀

2 流行情況

目前，國內外均有關于酵母菌侵染水產動物的報道，水產動物致病酵母流行情況見表2。徐榮彬等[7]發現，漢斯德巴氏酵母菌和二尖梅奇酵母感染羅氏沼蝦，該病的感染率和發病率在12月至翌年2月的低水溫期最高，而在高溫期6—9月間則無感染病例發生。蔡完其[9]報道，感染莫格球擬酵母菌的羅氏沼蝦，其在1991年底—1992年初的上海市及1998年寧波奉化區親蝦越冬中均有發生，該病傳染性極強，患病親蝦死亡率高達90%，嚴重影響蝦苗的產量[9,18,20-21]。許文軍等[10-12]曾報道，葡萄牙假絲酵母菌侵染梭子蟹導致其血淋巴乳化。早在20世紀90年代初便發現有患乳化病的梭子蟹，但由于病情及死亡狀況不嚴重而未引起重視，但該病在2000—2002年舟山市、2002—2004年寧波市及浙江其他沿海地區流行，患病梭子蟹死亡率高達40%[8]，病蟹即使不死也不具備商品價值，給梭子蟹養殖業造成了巨大經濟損失[22]。也曾有中華絨螯蟹感染二尖梅奇酵母而導致“乳化病”的報道，該病在2018年冬季首次被發現，隨后感染率逐年增加，目前呈全國蔓延趨勢，遼寧、黑龍江、吉林、天津、新疆等地區均有發現，感染率已超過20%，給河蟹養殖產業帶來了巨大損失[5-6]。除中國外，美國學者Moore等[15]也曾報道，美國大鱗大馬哈魚感染二尖梅奇酵母導致其死亡，死亡率高達34.5%。

3 傳播途徑和侵染機制

目前，關于水產動物致病酵母菌感染途徑和侵染機制的報道較少，由于水產動物致病酵母種類和寄主種類的差異，每種水產養殖動物被酵母侵染時的傳播途徑和感染機制并不完全相同。從目前的研究來看，致病酵母菌主要以水平傳播為主(表2)。如王國良等[8]發現，葡萄牙假絲酵母菌可以從梭子蟹的傷口進入體內，然后導致梭子蟹發病。董任彭等[20-21]發現，莫格球擬酵母菌侵染羅氏沼蝦時，是由于養殖池底水泥面被破壞后，水漏到下面成為積水，病原菌在積水中大量繁殖，該病原菌從空隙進入池水中，通過水平傳播進入蝦體內，導致羅氏沼蝦感染酵母菌而發病死亡。Lu等[19]發現，羅氏沼蝦是由于鰓和口接觸了池塘水體和底泥中的酵母菌而被感染。

表2 水產動物致病酵母菌流行情況

關于致病酵母菌侵染機制的更多研究集中在植物和人類上，如Mayer等[23]發現，白色假絲酵母菌是條件致病菌，通常在其消化道及產道的黏膜上，并不引起明顯的病理變化，但當宿主健康狀況不良時，此病原菌將會嚴重侵害其黏膜組織，甚至可侵入血液并波及其他臟器。Reese等[24]通過將α葡聚糖合成酶基因敲除試驗，發現α葡聚糖影響隱球菌毒力，突變株對宿主侵染能力降低，隱球菌會通過多糖莢膜錨定在宿主細胞表面，侵染宿主。O’meara等[25]發現，cAMP-PKA信號通路會調控Cryptococcusneoformans的Rim101轉錄因子，該轉錄因子參與了莢膜合成的調控及致病性。目前，對于水產動物致病酵母菌侵染機制的研究尚處于初始階段，余賀[26]發現，莫格球擬酵母具有莢膜結構，可以保護酵母免受溶菌酶、白細胞、補體等殺菌物的殺菌作用，侵入的酵母越多，蝦體中白細胞等殺菌物的殺菌作用越弱。許文軍等[10-12]發現，三疣梭子蟹的乳化病發病機理是葡萄牙假絲酵母在梭子蟹免疫力低時，侵入其血淋巴細胞，并隨血液循環進入各個組織中，侵染繁殖使梭子蟹發生病變。許文軍還通過對病蟹養殖環境進行研究，認為梭子蟹發病原因與蟹的體質及環境因子有較大關系。Moore等[15]發現，大鱗大馬哈魚攝食了感染二尖梅奇酵母的鹵蟲，魚體腸道消化二尖梅奇酵母子囊釋放出的針狀子囊孢子時，子囊孢子通過釋放時的機械力穿透大馬哈魚腸道而進入其血液中，進而通過血液循環系統感染各組織。Lodder等[27]認為，子囊孢子以尖端紡錘或針葉形式存在，由于孢子的橫截面直徑較小，這一特性使得孢子更容易穿透宿主腸壁。有關水生動物酵母病的感染途徑及發病機理仍需進一步研究，總體來說，水產動物致病酵母是條件致病菌，當宿主機體穩態失衡或外部環境發生顯著變化時，病原酵母會通過水平傳播，由破損皮膚或腸道等組織侵入機體體內，并隨血液循環系統感染各組織，進而引發組織病變而導致其死亡。

4 檢測方法

在魚類和蝦蟹類中均有因感染酵母菌而導致死亡的報道[7,9-12]，近年來，水產養殖動物因酵母菌引起的疾病有增多的趨勢，但病原個體微小，感染少量時各組織癥狀不明顯，較難在現場確診。雖然感染大量酵母菌的水產動物各組織病變癥狀明顯，如葡萄牙假絲酵母侵染三疣梭子蟹導致其體液和肌肉出現不同程度乳化現象[10-12]，但血卵渦鞭蟲也可導致梭子蟹出現該患病癥狀，因此，無法通過癥狀直接確定病原為酵母菌。

4.1 染色法

采用蘇木素-伊紅染色(H.E)、Mayen氏黏液卡紅染色等染色方法，染色后鏡檢可以初步判斷為酵母，但鏡檢方法并不能明確酵母的具體種類，且傳統的組織切片方法制作時間長、流程復雜，在致病酵母含量低的條件下不容易發現，不適合作為判斷是否感染發病的技術手段。

4.2 平板法

平板培養法是酵母菌的傳統檢測方法，可通過形態觀察和生理生化試驗等，將分析結果與Kurtzman等[3]的標準分類系統進行比對，從而鑒定出菌株的種屬，但這種方式費時費力，且重現性不好，一般需要5～7 d，耗時太長，不適用于快速檢測。涂小林[28]曾用乳膠凝集試驗檢測莫格球擬酵母，但過程也比較復雜。

4.3 分子生物學方法

相比之下，分子生物學方法鑒定更為快速、準確，已成為實驗室檢測致病酵母菌的常規手段[29]，目前常用的方法有普通PCR、實時熒光定量PCR(qPCR)等方法。

1)普通PCR(聚合酶鏈式反應)。PCR技術是最常用的酵母菌種類檢測方法之一。目前，針對酵母菌的檢測技術大多根據26S rDNA D1/D2和rDNA內轉錄間隔區(ITS rDNA)設計引物進行檢測[30-32]。由于相近物種間序列較為接近，需要測序才能確定到種水平，因此，需要針對具體種類進行特異性引物篩選才能進行種類鑒定。普通PCR技術存在的另一個問題是靈敏度不高，低量感染時會出現假陰性。

2)實時熒光定量PCR(qPCR)。qPCR檢測中常用的方法為染料法和探針法。染料法是根據SYBR Green染料與酵母菌的基因序列相結合，利用熒光顯色檢測模板含量，但該方法容易出現假陽性[33]。探針法的靈敏性及特異性比染料法好，但探針法檢測酵母時，大多是根據一種引物探針檢測一種酵母菌[34]。陳世瓊等[35]利用酵母菌的基因保守序列，建立了針對釀酒酵母、斯巴達克畢赤酵母、魯氏接合酵母和布魯塞爾德克酵母的qPCR鑒定方法，但該法操作比較繁瑣，工作效率低。余以剛等[34]通過設計酵母菌的通用型引物探針，建立了探針法，在特定酵母菌檢測中效果較好。

綜上所述，水產動物致病酵母菌的檢測方法目前還不完善，需進一步優化特定酵母菌病原的熒光定量方法，篩選特異性引物，提高靈敏度及避免假陽性等問題。此外，還需開展環介導等溫擴增(LAMP)、重組酶聚合酶擴增(RPA)等新的檢測技術，可以快速準確地用于致病酵母菌的檢測，以供水產養殖企業使用。

5 防治技術

目前，對于水產致病酵母菌的防治尚無有效藥物，因此，在養殖過程中對致病酵母菌首要還是以預防為主。如葡萄牙假絲酵母侵染三疣梭子蟹導致其乳化病的重要原因就是由于養殖環境變化、運輸中機械損傷、養殖密度過高、投飼不科學、池塘底質受到污染及水中有機質偏多等給病原菌提供了入侵機會，導致其發病[8]。預防方法應從改善養殖環境著手，如改善養殖池水質、定期撈取殘餌、控制養殖密度、提高養殖動物免疫力等[10-12,36-37]。針對表2中羅氏沼蝦感染莫格球擬酵母的相關途徑，預防方法主要是蝦池定期消毒、蝦定期檢疫、水質監測、水溫控制、合理投喂和及時撈除殘餌[9]。由于水產動物致病酵母多為機會性致病菌，養殖環節的管理不當均可能引起水產經濟動物感染致病酵母菌，還需在養殖的各個環節實施多方面預防措施。

在藥物治療方面，許文軍等[10-12]研究發現，制霉菌素、新潔爾滅和大蒜等藥物對葡萄牙假絲酵母具有良好的抑菌效果。馬紅麗等[6]發現，二尖梅奇酵母對酮康唑、氟康唑、益康唑、克霉唑、兩性霉素B、伊曲康唑、制霉菌素高度敏感。Zhang等[38]研究表明，馬索亞內酯對不同二尖梅奇酵母菌株均有較好的殺滅效果，最小抑菌濃度和最小殺菌濃度僅分別為0.15、0.34 mg/mL，熒光顯微鏡觀察發現，馬索亞內酯能破壞酵母細胞的完整性進而殺死酵母細胞。此外，利用酵母分泌的毒素不同原理，一些學者篩選了能夠殺滅致病酵母的海洋嗜殺酵母，并對毒素的分泌條件進行了研究，這些毒素對二尖梅奇酵母具有較好的殺滅作用[39-41]。目前，這些藥物均在體外取得了較好效果，若能在感染后的水產動物體內依然有效，則對于二尖梅奇酵母等致病酵母菌病的有效治療具有重要意義。

近期研究發現，抗菌肽[42]、微生態制劑[43]等也有較好的抑制酵母菌的作用。在藥物篩選時既要考慮用藥成本及對水產動物的安全性，也應考慮藥物在體內的吸收、分布、代謝及藥物殘留等情況，只有在安全無毒、價格合理的情況下才能在養殖生產中進行應用。此外，酵母菌的致病機理復雜，往往可能表現出細菌與酵母菌共侵染或多種病原侵染的特點，生產上較難直接應用藥物進行治療。當水生動物出現酵母病癥狀時，病情往往已進入感染中后期階段且難以治療，所以要做到早發現、早處置。對于現階段致病酵母菌的防治措施，應從改善養殖生態環境、控制養殖密度和加強水質管理等綜合防治環節入手，在以后科研中需加強水生動物酵母病的早期檢測與快速診斷技術，以及疾病綜合防控措施的研究，減少因酵母病造成的經濟損失。

6 存在的問題及展望

6.1 水產動物致病酵母菌研究中存在的問題

近年來，因致病酵母菌引起的水產動物病害不斷增加，嚴重影響到產業的健康發展。目前，雖然在致病酵母菌的研究上取得了一些進展，但要真正解決病害暴發問題，還有很多關鍵技術需要解決。

1)水產動物致病酵母菌的傳播途徑尚不明確，如其如何侵染給水產動物，環境中有哪些生物可以攜帶這些病原，這些生物是否會傳染給水產動物等。

2)致病酵母菌的流行規律尚不清楚，雖然知曉了該病的流行季節，但怎樣的水體環境能夠引起酵母菌發病還需深入闡明。

3)關于水產動物致病酵母菌的生活史和入侵機制研究還不深入，酵母菌進行無性繁殖或有性繁殖的條件、是否需要中間宿主，通過哪些組織入侵宿主體內及其入侵的手段，這些問題都需要深入研究以便于采取有利的應對措施。

4)目前尚無有效藥物對致病酵母菌進行殺滅，配套的預防措施尚未建立。

6.2 未來重點研究方向

針對目前水產動物中致病酵母菌研究存在的問題，今后應重點在以下方面開展研究：

1)加強對致病酵母菌的流行病學和分子流行病學調查。了解致病酵母菌病原的種類、宿主范圍、發生條件和流行規律、傳播途徑及變異情況等，明確這些問題有助于切斷病原的傳播途徑。

2)加強致病酵母菌的生活史和入侵機制研究。明確致病酵母菌生活史包含的不同階段，明晰其在環境中的存在形態及其形成不同形態結構的機制，以及是否需要中間宿主。目前，全基因組測序已被廣泛應用于流行病學、疫苗開發、微生物進化等領域，為微生物特異性生物學研究提供了分子生物學基礎，如致病機制、共生機制、獨特的代謝機制等，也為病原-宿主相互作用的發病機制提供了有益借鑒。目前，在NCBI已公布了二尖梅奇酵母等水產動物致病酵母全基因組，結合其他動植物病原真菌基因組信息，可利用分子生物學手段探究酵母病原菌的病原特性；同時，利用多組學聯合研究水產動物致病酵母菌的致病機理及其與寄主互作的分子機制，這對探索病害防控新策略具有重要指導意義。

3)隨著有機農業理念的引入和保護環境意識的增強，僅依靠藥物的單一水產病害防治技術迫切需要拓展和改進。基于改善宿主健康狀況和養殖生態環境的免疫制劑、綠色生物漁藥、綠色生態制品在水產中的開發和應用將逐步取代目前藥物濫用的局面。目前，以健康養殖技術為基礎的水生動物病害綜合防疫體系是國際上普遍認可和接受的漁業病害防治技術系統。因此，今后建立一個對宿主和環境都有利的綠色綜合防控技術，聯合應用生物、免疫、生態技術加入水產動物致病酵母疫病的防控體系中是未來的發展趨勢。

總之，酵母菌病的發生是病原、環境及養殖水產動物三者相互作用的結果，因此，明確致病酵母菌的傳播途徑、生活史、入侵機制及與宿主的互作等基礎理論，加強抗病育種研究，提供良好的養殖環境，是解決致病酵母菌對水產動物危害的有效途徑。