香螺線粒體COXⅠ和CYTB基因遺傳多樣性研究

張旦旦，王煜，李卓，田瑩，王犖，毛俊霞，王許波，常亞青，郝振林

(大連海洋大學 農業農村部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

香螺Neptuneacumingii隸屬于軟體動物門Mollusca腹足綱Gastropoda新腹足目Neogastropoda蛾螺科Buccinida，其殼近菱形，殼質堅硬，顏色為淺褐色，螺層約為7層[1]。香螺為冷水性大型種類，其肉質鮮美肥嫩，營養豐富，富含有人體必需的微量元素[2]。香螺肉可加工成干制品，也可鮮食，深受人們喜愛[3]，市場價格近120元/kg，經濟價值較高，是非常具有增養殖潛力的螺類。香螺分布范圍較小，在中國主要分布于黃、渤海海域[4-5]，日本、朝鮮海域也有分布[6]。

目前，關于香螺的研究較少，主要集中于香螺殼質[7]、營養元素[8]、繁殖生物學[9]等方面。近年來，有學者初步開展了香螺遺傳多樣性的研究，隋娜[10]基于微衛星標記的方法研究了遼寧及山東5個地理群體香螺的遺傳多樣性，發現地理位置與遺傳多樣性存在一定的聯系。日本學者Azuma等[11]利用分離的多態微衛星標記技術分析了日本北海道海域香螺種群的遺傳多樣性，發現基因可用于鑒定香螺種群和親緣關系。然而微衛星技術在PCR擴增時可能會出現無效基因的情況，進而影響群體的鑒定結果[12]。本研究中，通過分析中國黃、渤海海域6個不同地理群體香螺COXⅠ和CYTB基因的遺傳多樣性水平，試圖明確中國香螺遺傳多樣性水平和種質遺傳背景，旨在為香螺健康養殖及其資源保護和種質管理提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用香螺于2017年6—10月采自大連市大連灣(DL)、大連市獐子島縣(ZZ)、大連市旅順鹽場(LS)、煙臺市八角港(YT)、威海市(WH)、蓬萊市長島縣(PL)6個海域，樣本各10尾，用保溫箱運回至大連海洋大學農業農村部北方海水增養殖重點實驗室。解剖，剪取每尾個體的腹足肌組織，用過濾海水洗凈，稱重，并于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、COXⅠ和CYTB基因擴增及測序 剪取香螺腹足肌組織約20 mg，剪碎并裝入離心管。采用TIANGEN 海洋動物基因組提取試劑盒提取DNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并用紫外分光光度計測量DNA的質量和濃度，于冰箱(-20 ℃)中保存備用。

香螺線粒體COXⅠ基因擴增引物為

F：5′ATGCGTTGATTATTTTCKACAAATCA 3′；

R：5′TCTTGAAATCCTARTTGTCCTCATAG 3′。

線粒體CYTB基因擴增引物為

F：5′CTTCCCTTCGTCCTTTCAAT 3′；

R：5′GACAAATATTCCCCAGGAATAAC 3′。

PCR反應體系(50 μL)包括：10×Buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L)5 μL，上、下游引物各2 μL(10 μmol/L)，模板DNA(50 μg/μL)5 μL，ddH2O 31 μL。反應條件為：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下變性30 s，50 ℃(COXⅠ基因)或55 ℃(CYTB基因)下退火復性30 s，72 ℃下延伸120 s，共進行30個循環；最后在72 ℃下再延伸10 min，在4 ℃下保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物并送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1.2.2 序列分析 使用BioEit軟件對測序結果進行比對。采用BLAST檢索確定目的基因。采用DNASP 5.0(DNA Sequence Polymorphism)軟件確認單倍型數，計算6個不同海域群體內核苷酸多樣性指數(Pi)、核苷酸差異系數(K)。采用MEGA 5.0軟件計算COXⅠ和CYTB基因的堿基組成、變異位點數并構建單倍型分子系統進化樹，Bootstrap 重復1 000 次檢驗置信度。采用TCS 1.21軟件制作單倍型網絡支系圖，以分析6個不同群體的親緣關系。采用分子方差分析法(AMOVA)分析香螺不同群體間的遺傳分化，并計算遺傳分化系數(Fst)。

2 結果與分析

2.1 香螺COXⅠ和CYTB基因序列的堿基組成及變異分析

香螺線粒體COXⅠ和CYTB基因長度分別為1 536 bp和1 140 bp。變異位點中，兩基因均未發現插入/缺失位點。COXⅠ基因檢測到141個多態位點，11種單倍型，CYTB基因檢測到34個多態位點，14種單倍型；線粒體COXⅠ基因的T、C、A、G平均堿基含量分別為38.7%、16.2%、27.2%、18.0%，線粒體CYTB基因的T、C、A、G平均堿基含量分別為40.4%、17.0%、28.0%、14.6%(表1)。通過對6個不同群體間COXⅠ和CYTB堿基組成對比發現，兩基因的堿基組成較為接近，且A+T堿基含量均大于G+C。

表1 香螺COXⅠ和CYTB 基因序列的堿基組成

2.2 6個不同海域香螺COXⅠ和CYTB基因的單倍型分布

香螺線粒體COXⅠ基因的單倍型分布見表2，其中，WH群體獨有的單倍型是COXⅠ-03，YT群體獨有的單倍型是COXⅠ-5和COXⅠ-6，ZZ群體獨有的單倍型是COXⅠ-8和COXⅠ-9，DL群體獨有的單倍型是COXⅠ-10和COXⅠ-11。香螺線粒體CYTB基因單倍型分布見表3，其中，ZZ群體獨有的單倍型是CYTB-3、CYTB-5和CYTB-6，LS群體獨有的單倍型是CYTB-7、CYTB-8和CYTB-10，YT群體獨有的單倍型是CYTB-11和CYTB-14，WH群體獨有的單倍型是CYTB-12，PL群體獨有的單倍型是CYTB-13。

（2）首先檢查SDH電源是否故障，如果有即修復電源，修復后SDH若無告警則流程轉入第（4）步。若SDH告警為次要告警，則流程轉入第（3）步。若為主要告警，先對兩端SDH在ODF處自環，若告警不消除，則需要對ODF和SDH排查和檢修，ODF檢修為更換尾纖或光接頭，SDH檢修則為找出故障板卡并更換。若無主要告警，環回方式改成如下，在其中一端ODF處環回給對端，觀察對端是否有主要告警，若有告警即可診斷為光鏈路或中繼 SDH故障，需要參考專用保護通道故障定位處理方法解決故障，并消除中繼SDH故障。

表2 香螺各群體COXⅠ基因單倍型分布情況

表3 香螺各群體CYTB基因單倍型分布情況

2.3 香螺各群體內COXⅠ和CYTB基因的遺傳多樣性分析

6個香螺群體內COXⅠ和CYTB基因的遺傳參數如表4所示，COXⅠ及CYTB基因的平均核苷酸差異數K值變化范圍分別為0.000～31.133和1.222～13.444，COXⅠ基因K值變化范圍較大，且DL群體最高，為31.133，遠大于其他群體；核苷酸多樣性指數Pi分析顯示，COXⅠ基因中，DL群體的Pi值最高，為0.021 21，PL群體的Pi值最低，為0，而CYTB基因中，LS群體的Pi值最高，為0.012 36，PL群體的Pi值最低，為0.001 14。

表4 6個不同海域香螺COXⅠ和CYTB基因的群體遺傳多樣性參數

2.4 香螺各群體間COXⅠ和CYTB基因遺傳多樣性分析

6個群體間的遺傳參數如表5所示，香螺各群體間COXⅠ及CYTB基因K值變化幅度分別為24.971～2.094和11.497～1.395，COXⅠ基因K值變化幅度較大；COXⅠ基因中，YT和PL群體間的K值最低，DL與LS群體間的K值最高；在CYTB基因中，LS和其他群體間的核苷酸差異數與其他群體兩兩相比差異較大，表明LS群體是6個群體中差異較為明顯的群體。另外，在COXⅠ基因中，DL群體與ZZ、YT、WH群體間未發現共享的遺傳位點，PL群體與其他5個群體間也未發現共享的遺傳位點；但在CYTB基因中，DL群體與ZZ、YT、WH群體間有22個共享的遺傳位點，且PL群體與DL、ZZ、LS、YT及WH群體的共享遺傳位點數分別是22、44、46、26和44(表5)。

表5 6個不同海域香螺群體間的COXⅠ和CYTB基因平均核苷酸差異數K(對角線下)及共享變異位點(對角線上)

2.5 香螺COXⅠ和CYTB基因單倍型系統進化樹及網絡圖分析

使用MEGA5.0軟件制作單倍型系統進化樹,結果如圖1和圖2所示。在COXⅠ基因中，有3個分支的單倍型聚類，分別為具有最大優勢分支的單倍型COXⅠ-06、COXⅠ-09、COXⅠ-02、COXⅠ-01、COXⅠ-11、COXⅠ-04、COXⅠ-05，單倍型COXⅠ-03、COXⅠ-07、COXⅠ-08為一個分支，僅單倍型COXⅠ-10單獨為一個分支(圖1)；CYTB基因中，有2個分支的單倍型聚類，一類為最大的優勢分支單倍型CYTB-02、CYTB-04、CYTB-08、CYTB-06、CYTB-10、CYTB-09、CYTB-13、CYTB-05、CYTB-11、CYTB-14，另一類為單倍型CYTB-03、CYTB-12、CYTB-01、CYTB-07分支(圖2)。

圖1 COXⅠ基因單倍型系統進化樹

圖2 CYTB基因單倍型系統進化樹

使用TCS 1.21軟件制作單倍型網絡圖如圖3和圖4所示，其中，COXⅠ和CYTB基因在不同群體間單倍型交錯分布, 且未出現明顯地理差異。在COXⅠ基因中，最大的優勢分支COXⅠ-02位于網絡圖的最中心；在CYTB基因中，兩分支中均有一個單倍型位于網絡圖的中心，分別是大分支的單倍型CYTB-02，小分支的單倍型CYTB-01。COXⅠ和CYTB基因單倍型網絡圖得到的結果與單倍型系統進化樹相似。

圖中每一個圓圈代表需要進行一次變異，下同。

圖4 CYTB基因單倍型網絡圖

2.6 香螺各群體間的遺傳變異分析

從表6可見：COXⅠ和CYTB基因各群體間遺傳距離分別為0.002～0.018和0.001～0.005；COXⅠ基因中，DL群體與ZZ、LS、YT、WH、PL群體的遺傳距離分別為0.014、0.018、0.014、0.015、0.012，其他5個群體間的遺傳距離均小于0.012，其中ZZ、YT、PL群體之間的遺傳距離最小，分別為0.003、0.002、0.002；CYTB基因中，LS群體與其他5個群體間的遺傳距離均為0.005，而其他5個群體間的遺傳距離均小于0.005，YT、PL、ZZ群體間的遺傳距離最小，均為0.001。

表6 6個不同海域香螺群體間COXⅠ和CYTB的遺傳距離

從AMOVA分析結果中(表7)可知：COXⅠ和CYTB基因Fst指數分別為0.099 31和0.180 89，P值均大于0.05，說明群體間的遺傳分化并不明顯；另外，香螺6個群體內COXⅠ和CYTB基因變異比例分別為90.07%和81.91%，群體間變異比例分別為9.93%和18.09%，說明群體內有較為明顯的遺傳分化。

表7 基于6個不同海域香螺群體COXⅠ和CYTB基因序列的AMOVA分析

3 討論

3.1 香螺遺傳多樣性

遺傳多樣性是物種生存發展的前提，也是其物種進化的潛力和適應環境能力的基礎，更是物種多樣性的基礎[13]。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是一個物種遺傳多樣性的衡量指標，因此，單倍型多樣性和核苷酸多樣性值越大，物種的遺傳多樣性越豐富，但當研究數量較少時，核苷酸多樣性比單倍型多樣性更具有說服力[14-15]。根據Grant等[16]提出的標準，核苷酸多樣性指數以0.005為臨界線，高于0.005說明物種的遺傳多樣性較豐富。本研究中，COXⅠ和CYTB基因在WH群體中核苷酸多樣性指數為0.006 44和0.007 94，均大于0.005，推測可能是因為威海水資源的開發利用較小，遺傳多樣性較豐富。此外，還可能與其地理位置有關，威海緯度較低，這對氣溫和水溫有一定的影響，使其形成了一定的差異。

3.2 香螺單倍型分布及系統發育

本研究表明，在COXⅠ基因中，單倍型系統進化樹和單倍型網絡圖均有3個大分支，分析結果基本相同，不同群體在單倍型分布上并未出現明顯的地理差異，在群體中占比較大的單倍型是該群體中的優勢單倍型，有1～2種。在CYTB基因中，單倍型系統進化樹和單倍型網絡圖均出現兩個分支，分析結果基本相同，且未發現明顯的地域差異，但ZZ、YT、WH、PL群體有獨有單倍型，說明交叉現象會在不同群體中出現。其中，最大優勢分支單倍型COXⅠ-02和CYTB-02位于網絡圖最中心且占比最高，依據溯祖理論，祖先類型應是占比最高的單倍型[17]，因此，推測中國黃、渤海海域的祖先類型可能為單倍型COXⅠ-02和CYTB-02。

3.3 香螺COXⅠ和CYTB基因的遺傳距離和遺傳分化

本研究表明，在COXⅠ基因中，從單倍型系統發育樹和單倍型網絡圖可以看出，各群體間產生了穿插滲透的現象，未出現明顯的群體差異，且單倍型和變異位點較豐富，說明群體間有較高的遺傳滲透率和遺傳相似度，這與趙丹等[18]對泥螺BullactaexarataCOXⅠ基因部分片段的研究結果相似。在CYTB基因中，LS群體的單倍型數、多態位點數、平均核苷酸差異數、核苷酸多樣性指數、群體間遺傳參數和遺傳距離等指標均高于其他5個群體，說明LS群體與其他5個群體有較為明顯的差異，且遺傳背景及遺傳多樣性方面要優于其他群體，說明物種對環境的適應力與遺傳多樣性豐富度成正比[19-20]。Shaklee等[21]提出，魚類在種群的遺傳距離標準為0.05～0.30。依據此標準，本研究中6個不同海域群體香螺在COXⅠ基因中，DL群體和LS群體的遺傳距離最大，為0.018，小于種群的標準0.05；在CYTB基因中，群體間最大的遺傳距離為0.005，小于種群的標準。表明6個不同海域的香螺未達到亞種分化。

本研究中AMOVA分析顯示，香螺COXⅠ和CYTB基因群體內變異都遠大于群體間差異，COXⅠ基因差異的主要原因是群體內變異為群體，說明COXⅠ基因與其地理位置并未有明顯的相關性。王旭[22]通過COXⅠ和16S rRNA分析了黃口荔枝螺Thaisluteostoma和疣荔枝螺Reishiaclavigera的遺傳多樣性，結果顯示，在整個遺傳變異中群體內的遺傳變異最大，無明顯的地理結構和譜系結構，表明群體間不存在顯著的遺傳分化，本研究結果與之相似。COXⅠ基因中，從單倍型、變異位點數、遺傳距離等幾個指標中可以發現，DL群體均大于其他5個群體，說明在遺傳背景和遺傳多樣性方面DL群體與ZZ、LS、YT、WH、PL群體相比較為豐富。楊建敏等[23]通過對遼寧至山東的脈紅螺Rapanavenosa7個群體16S基因的遺傳多樣性進行研究，認為大連市大連灣群體是遺傳背景最為豐富的群體。本研究中CYTB基因差異的主要原因，推測認為是該基因片段未能出現明顯的地域差異。

3.4 香螺資源保護

香螺分布范圍和移動范圍較小，繁殖力較弱，由于捕撈強度變大，目前出現了顯著的資源衰竭[1]。因此，當前要采取有效措施保護其資源。本研究中初步反映了香螺的遺傳背景，為制定相關的保護措施提供了依據。筆者認為，可通過多種方式對香螺的資源進行保護：1)保證香螺的餌料資源；2)嚴格限制捕撈的工具；3)從生產的實際情況考慮，嚴格控制捕撈期。然而，若從遺傳多樣性角度分析香螺的資源，還需通過其他技術獲取相關的分子數據庫。

4 結論

1)中國不同海域間香螺遺傳多樣性較為豐富，威海群體COXⅠ和CYTB基因的核苷酸多樣性指數較高，均大于0.005。

2)不同海域間香螺具有群體獨有的單倍型，可作為鑒別不同地理種群的重要依據。

3)不同海域間香螺未出現明顯的群體間差異，但群體內變異遠大于群體間差異，不同海域間香螺未達到亞種分化水平。