餌料種類、配比及投喂方式對單環刺螠幼蟲生長和變態的影響

胡麗萍，姜黎明，張建柏，趙強，黃華，王力勇

(煙臺市海洋經濟研究院，山東 煙臺 264000)

單環刺螠Urechisunicinctus俗稱海腸子，隸屬于螠蟲動物門Echiurioidea螠綱Echiurida無管螠目Xenopneusta刺螠科Urchidae刺螠屬Urechis。單環刺螠自然分布于俄羅斯、朝鮮、日本等國海域，以及中國的黃、渤海沿岸，是生活在海邊潮間帶泥性底質或珊瑚礁區中的管狀螠蟲動物[1]，因其肉味鮮美、營養豐富，被稱為“裸體海參”[2]，具有較大的養殖開發前景。有研究發現，單環刺螠體內存在多種生物活性物質，可為開發海洋生物藥品、保健品提供新資源[3]。目前，單環刺螠的供應絕大部分依賴采捕野生資源，隨著價格不斷提高，采捕強度越來越大，野生資源衰退嚴重。因此，生產過程中非常有必要開展苗種規模化擴繁和增養殖工作。

目前，中國學者已在單環刺螠生態學[4-8]、繁殖發育生物學[9-10]等方面開展了相關研究，為開展養殖生產奠定了一定理論基礎。一些科研單位和企業也嘗試進行了單環刺螠的人工苗種繁育[2,11-13]及養殖試驗[14-15]，并獲得了一定的養殖參數數據。常林瑞等[16]報道了餌料對單環刺螠幼體生長的影響，而有關餌料對單環刺螠幼蟲生長發育及變態的影響研究尚未見報道。

餌料是動物生長與發育的營養基礎，餌料品種的選擇與科學投喂是經濟物種苗種繁育成功與否的核心技術。本研究中，比較了不同餌料品種、餌料配比及餌料投喂方式對單環刺螠幼蟲生長發育和變態的影響，旨在確定適宜幼蟲生長和發育的最佳餌料系列及投喂方法，為單環刺螠規模化人工育苗生產提供餌料參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用單環刺螠親體取自“煙臺海腸”地理標志保護范圍內的煙臺海域。為取得發育起點較同步的幼蟲，本試驗中通過解剖人工暫養的親體獲取精子和卵子，經人工授精并孵化，獲得同源初孵擔輪幼蟲。

1.2 方法

1.2.1 幼蟲培養 幼蟲培育容器為玻璃水槽(50 cm×30 cm×40 cm)，水深為33 cm，底面積為0.15 m2，試驗水體體積為50 L。試驗期間連續充氣，水溫控制在15.8～20.6 ℃，鹽度為27.3～30.2，pH為7.8～8.2，光照強度為500 lx以下。幼蟲初始培育密度為0.25 ind./mL。每個試驗組設3個重復。每天上午換水1次，換水量為總水量的 1/2。在換水后進行投餌，日投喂2～3次。換水前觀察幼蟲攝食及活動情況。

投餌量的確定方法：投喂前檢測水中存留餌料細胞的密度和幼蟲胃飽滿程度，以幼蟲胃飽滿時水中餌料細胞密度達到1×104cells/mL左右為標準，確定適宜的投喂量。

變態底質的處理與投放：海沙曝曬2～3 d后，使用350 μm篩網過濾，去掉雜質和大顆粒物質；加入質量濃度為5×10-6mg/L的高錳酸鉀溶液浸泡12 h；反復用過濾海水沖洗干凈后備用。在空水槽底部投放經處理的海沙作為變態底質，鋪設厚度為2～3 cm，當幼體發育至蠕蟲狀幼蟲階段時，對幼蟲進行收集并移入該水槽。

1.2.2 餌料種類 試驗餌料包括活性餌料和人工代用餌料兩大類，活性餌料為球等鞭金藻Isochrysisgalbana(編號A)、小球藻Chlorellavulgaris(編號B)、小新月菱形藻Nitzschiaclosteriumf.minutissima(編號C)和海洋紅酵母(大連益參寶飼料有限公司)(編號D)，人工代用餌料為活性干酵母(安琪酵母，湖北武漢)(編號E)。

1.2.3 單一餌料和混合餌料投喂試驗 試驗共設置11個試驗組，分別記為A、B、C、D、E、A+B、B+C、D+E、A+B+C、A+B+D、A+B+E，分別投喂5種單一餌料和6種混合餌料。混合餌料投喂組中各組分均按細胞數等量使用，最終使每組細胞數量相同。試驗幼蟲種類包括從初孵擔輪幼蟲至蠕蟲狀幼蟲的各階段。

1.2.4 餌料配比及投喂方式試驗 根據混合餌料投喂試驗結果，確定最佳混合餌料品種。按照表1中的餌料配比和投喂方式設置各試驗組，依據幼蟲的生長速度與變態率確定最佳投喂方式和各發育階段幼蟲的適宜投喂量。試驗幼蟲種類包括從初孵擔輪幼蟲至蠕蟲狀幼蟲的各階段。

表1 餌料配比及投喂方式試驗設計

1.2.5 幼蟲的收集與計數 單環刺螠擔輪幼蟲和體節幼蟲均為浮游狀態，使用75 μm篩絹獲取；蠕蟲狀幼蟲為底棲生活，獲取方法如下：用水流沖擊水槽底部，使幼苗與底質分離，將浮起的幼蟲連同槽內海水一起倒入106 μm的網箱中，反復操作至底質內無幼苗為止，收集網箱內的幼苗并沖洗干凈，瀝水后測量體長并稱其質量。隨機取樣3次，取平均值并計算出該水槽內的幼苗總數。

1.2.6 生長速度的測定 試驗期間，使用目微尺分別檢測初孵擔輪幼蟲和后期體節幼蟲(12體節)的體長。每組隨機抽取30個個體，并計算其平均值。體長日增長率計算公式為

體長日增長率=(后期體節幼蟲體長-初孵擔輪幼蟲體長)/(初孵擔輪幼蟲體長×生長時間)×100%。

1.2.7 幼蟲成活率及變態成活率的測定 當幼蟲全部發育到體節幼蟲時，測定幼蟲成活率；當在水中無浮游幼蟲5 d后，從底質中分離出蠕蟲狀幼蟲幼苗，測定幼蟲變態率。計算公式為

1.2.8 幼蟲發育齊整度的測定 通過計算組內水中無浮游幼蟲時間與最早出現蠕蟲狀幼蟲時間之差，評估組內幼蟲發育的整齊程度。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0軟件對試驗數據進行單因子方差分析，檢驗方差齊性，采用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 關鍵節點幼蟲的形態特征

受精約24 h后觀察到早期擔輪幼蟲，營浮游生活(圖1(a))，此時幼蟲呈梨形，身體分上下兩個半球，上半球頂部具頂纖毛束，在體圍最大處有兩個纖毛環，在蟲體下半球靠近末端處，還有一圈尾端纖毛環,此時幼蟲長×寬約144 μm×168 μm。

受精后8～15 d，發育至體節幼蟲，幼蟲陸續下沉并在底質表面爬行(圖1(b))，后期體節幼蟲體長896.5～939.2 μm不等。

當水體中基本無浮游幼蟲時，從水槽底部沙床中收集的幼蟲主要為蠕蟲狀幼蟲，蟲體呈透明狀，消化道清晰可見(圖1(c))，此時幼蟲體長為2.1～5.0 mm，體質量為1.29～2.15 mg。

2.2 不同種類餌料對幼蟲生長發育和存活的影響

不同種類餌料投喂對單環刺螠初孵擔輪幼蟲至體節幼蟲期間的體長日增長率、體節幼蟲體長和幼蟲成活率(表2)，以及對初孵擔輪幼蟲至出現蠕蟲狀幼蟲的時間和幼蟲變態率(表3)等均存在一定的影響。在單一餌料投喂組中，小球藻(B)和球等鞭金藻(A)投喂組幼蟲體長日增長率顯著高于其他單一餌料投喂組(P<0.05)，但A組和B組間無顯著性差異(P>0.05)，在海洋紅酵母(D)單一餌料投喂組中，單環刺螠初孵擔輪幼蟲未能成功發育成為體節幼蟲；所有餌料投喂組幼蟲生長的多重比較分析結果顯示，A+B混合餌料和A+B+E(酵母粉)混合餌料組的初孵擔輪幼蟲至后期體節幼蟲時的體長日增長率顯著高于其他餌料組(P<0.05)，但A+B組和A+B+E組間無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

從整個浮游期幼蟲的成活率來看，A、B單一餌料投喂組的體節幼蟲成活率顯著高于其他單一餌料投喂組(P<0.05)，但A、B餌料組間幼蟲成活率無顯著性差異(P>0.05);所有餌料投喂組幼蟲成活率的多重比較分析結果顯示，A、B餌料組及所有包含A+B的混合餌料組中體節幼蟲成活率均在67%以上，且顯著高于其他餌料組(P<0.05)，其中，A+B混合餌料組的幼蟲成活率最高(72.96%±1.27%)，但與A+B+C、A+B+D和A+B+E混合餌料組相比無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同餌料投喂組后期體節幼蟲體長、初孵擔輪幼蟲至后期體節幼蟲體長的日增長率及體節幼蟲成活率

從初孵擔輪幼蟲至出現蠕蟲狀幼蟲的發育時間分析，A和B兩個單一餌料投喂組的初孵擔輪幼蟲至出現蠕蟲狀幼蟲的時間顯著短于其他單一餌料投喂組(P<0.05)，但A、B組間無顯著性差異(P>0.05)，D單一投喂餌料組中，單環刺螠初孵擔輪幼蟲未能成功發育成為蠕蟲狀幼蟲;所有餌料投喂組幼蟲生長發育時間的多重比較分析結果顯示，含有A和/或B的單一及混合餌料組的初孵擔輪幼蟲至出現蠕蟲狀幼蟲時間均顯著短于其他餌料組(P<0.05)，尤其是A+B和A+B+E混合餌料組的初孵擔輪幼蟲至出現蠕蟲狀幼蟲時間分別為(16.00±0.03)、(17.30±0.03)d，顯著短于其他餌料組(P<0.05)(表3)。

表3 不同餌料投喂組初孵擔輪幼蟲至出現蠕蟲狀幼蟲的時間及幼蟲變態率

從幼蟲變態率來看，A、B兩個單一餌料投喂組的幼蟲變態率顯著高于其他單一餌料投喂組(P<0.05)，且A、B組間幼蟲變態率有顯著性差異(P<0.05);所有餌料投喂組幼蟲變態率的多重比較分析結果顯示，A、B及所有包含A+B的混合餌料組中幼蟲變態率均在15%以上，且顯著高于其他餌料組(P<0.05)，其中，A+B+E投喂組幼蟲變態率最高(21.72%±0.85%)，顯著高于其他餌料組(P<0.05)。

2.3 餌料配比和投喂方式對幼蟲變態的影響

參考“2.2節”試驗結果，綜合考慮幼蟲成活率和變態率情況，結果表明，小球藻+球等邊金藻+酵母粉的混合餌料投喂組整體培育效果最佳。在此基礎上，設計了該組3種餌料在不同配比和投喂方式下對幼蟲變態的影響試驗。結果顯示，不同餌料配比和投喂方式對單環刺螠組內幼蟲發育齊整度(水中無浮游幼蟲時間與最早出現蠕蟲狀幼蟲時間差)和變態率存在顯著影響(表4)。從幼蟲變態率來看，當投喂方式相同(即同時搭配投喂或分期投喂)、餌料配比不同時，小球藻、球等鞭金藻、酵母粉3種餌料按照2∶1∶1比例混合投喂試驗組(Ⅱ、Ⅴ組)的幼蟲變態率顯著高于同種投喂方式下其他比例試驗組(P<0.05);所有試驗組幼蟲變態率的多重比較分析結果顯示,小球藻、球等鞭金藻、酵母粉3種餌料按照2∶1∶1比例混合，在擔輪幼蟲前期只投喂小球藻+金藻，至擔輪幼蟲中后期增加投喂酵母粉的試驗組(V組)的幼蟲變態率最高(24.73%±0.78%)，且顯著高于其他各組(P<0.05)(表4)。

表4 小球藻、球等鞭金藻、酵母粉3種餌料配比和2種投喂方式對初孵擔輪幼蟲至出現蠕蟲狀幼蟲的時間、水中無浮游幼蟲時間與最早出現蠕蟲狀幼蟲時間差及幼蟲變態率的影響

從水中無浮游幼蟲時間與最早出現蠕蟲狀幼蟲時間差來看，當投喂方式相同，餌料配比不同時，小球藻、球等鞭金藻、酵母粉3種餌料按照2∶1∶1比例混合投喂試驗組(II和V組)的水中無浮游幼蟲時間與最早出現蠕蟲狀幼蟲時間差顯著小于同種投喂方式下的其他比例試驗組(P<0.05);所有試驗組水中無浮游幼蟲時間與最早出現蠕蟲狀幼蟲時間差的多重比較分析結果顯示，II組和V組的水中無浮游幼蟲時間與最早出現蠕蟲狀幼蟲時間差分別為(2.8±0.31)、(3.0±0.21)d，兩者均顯著小于其他各組(P<0.05)，但II和V組間無顯著性差異(P>0.05)。水中無浮游幼蟲時間與最早出現蠕蟲狀幼蟲時間差越小，表明組內幼蟲發育齊整程度越好。

2.4 不同發育階段幼蟲的適宜投喂量

參考“2.2節”和“2.3節”試驗結果，綜合考慮成活率和變態率均較高的投喂組為小球藻、球等鞭金藻、酵母粉3種餌料按照2∶1∶1比例混合，在擔輪幼蟲前期只投喂小球藻+金藻，至擔輪幼蟲中后期增加投喂酵母粉的試驗組。進一步根據試驗過程中對水中存留餌料細胞密度測量及對幼蟲胃飽滿程度觀察，獲得幼蟲不同培育階段適宜餌料日投喂量及投喂方法(表5)。初孵擔輪幼蟲期餌料日投喂量為2×104cells/mL，隨著幼蟲發育餌料投喂量逐漸增加，當出現蠕蟲狀幼蟲時，餌料投喂數量增加至10×104～12×104cells/mL。

表5 幼蟲不同培育階段的餌料日投喂量及投喂方法

3 討論

3.1 搭配小球藻和球等鞭金藻的餌料更適合單環刺螠幼蟲的生長發育

動物幼蟲的生長發育受許多因素影響，合適的餌料是幼蟲生長發育和提高存活率的重要影響因子

之一。餌料品種不適宜，會大大降低幼蟲的生長發育速度，甚至導致幼蟲變態失敗和發育終止[17]。本研究結果顯示，單一餌料投喂時，小球藻投喂組與球等鞭金藻投喂組的體節幼蟲體長日增長率和幼蟲成活率均顯著高于其他單一餌料投喂組；混合餌料投喂結果顯示，含有小球藻和/或球等鞭金藻的餌料混合組中體節幼蟲的成活率和蠕蟲狀幼蟲的變態率均顯著高于其他餌料投喂組，其中，小球藻+球等邊金藻+酵母粉的混合餌料投喂組整體培育效果最佳，這表明小球藻和球等鞭金藻是單環刺螠幼蟲生長發育的較好鮮活餌料品種，同時考慮混合餌料可以更全面地提供幼蟲發育所需要的營養，以及降低育苗成本，建議在單環刺螠苗種大規模繁育中使用小球藻+球等鞭金藻+酵母粉或其他低成本餌料。本研究中，混合餌料投喂可以更有效地促進幼蟲生長和發育的結論與常林瑞等[16]報道的餌料對單環刺螠幼螠生長影響的研究結果一致。

3.2 不同發育階段幼蟲對餌料的選擇不同

不同生物種類幼蟲發育對餌料的選擇是不同的，同種生物幼蟲不同發育階段對餌料的種類要求也不一樣。如大多數貝類剛孵化的幼蟲因口徑較小，開口餌料一般會選擇細胞較小的金藻或者小球藻等，當幼蟲發育到口徑較大的殼頂初期后，可投喂細胞較大的扁藻[18]。方格星蟲的孵化幼蟲因口徑比較大，目前人工育苗常用的十幾種單細胞藻類均可作為其開口餌料，但進一步研究顯示，作為開口餌料投喂時，金藻試驗組要比扁藻試驗組獲得的方格星蟲日增長率更高[18]。本研究中單一餌料投喂結果顯示，小球藻與球等鞭金藻投喂組的單環刺螠體節幼蟲成活率和體長日增長率相當，但小球藻投喂組的蠕蟲狀幼蟲變態率要顯著高于球等鞭金藻投喂組，故用單一餌料投喂時，小球藻是作為單環刺螠開口餌料更好的選擇。不同餌料配比及投喂方式對幼蟲變態影響的試驗結果顯示，將小球藻、球等鞭金藻、酵母粉3種餌料按照2∶1∶1的比例混合搭配，在擔輪幼蟲前期只投喂小球藻+球等鞭金藻，至擔輪幼蟲中后期增加投喂酵母粉，能夠獲得較高的幼體成活率和變態率，故將其確定為單環刺螠幼蟲不同發育階段的最佳餌料投喂方案。

另外，本研究中不同餌料配比及投喂方式對幼蟲發育和變態時間影響的試驗結果顯示，餌料中小球藻的投喂比例偏高或偏低時，水中無浮游幼蟲時間與最早出現蠕蟲狀幼蟲時間差均會延長，即幼蟲發育齊整度會降低，將不利于幼蟲變態集中進行；相同的餌料配比時，推遲使用酵母粉，幼蟲發育及變態時間會有所延長；增加酵母粉使用比例，幼蟲發育及變態時間也會相對延長。因此，合理控制餌料中小球藻的使用比例，并適時增加投喂酵母粉，對提高幼蟲發育的齊整度及幼蟲變態率可起到促進作用。以上研究結果均表明，餌料的營養效果與幼蟲發育的階段性需求有很大的關系[18]。建議在進行幼蟲培育時，有必要根據幼蟲的不同發育階段適當調整餌料的品種和配比。

3.3 適宜投餌量應根據幼蟲培育密度確定

除餌料品種外，餌料數量也是關系到幼蟲培育成功的又一關鍵要素。幼蟲發育進入一個新階段，需要消耗大量的體能。在單環刺螠幼蟲培育過程中，足量投喂適宜的餌料是苗種繁育工作成功的關鍵。本研究結果顯示，當餌料品種適宜，但投喂量不足時，會致使幼蟲生長緩慢，成活率與變態率大幅降低，在發育進入下一個階段時，極易出現大量死亡甚至全部死亡的情況。這應該與幼蟲營養儲備不足有著直接關系。這與蘭國寶等[18]對方格星蟲幼體餌料研究的結果一致。但是，餌料密度并非越高越好，本研究中餌料數量對幼蟲生長發育影響的試驗結果，以及蘭國寶等[18]對方格星蟲幼體餌料研究的結果均表明，當投餌密度過高時，幼蟲存活率也會下降。一般情況下，投餌量的多少應與幼蟲培育密度有關。在人工培育過程中，幼蟲的培育密度不宜過大，本研究中采取綜合考慮培育水體中餌料細胞的數量和幼蟲攝食情況兩個方面，通過對投喂前水中存留的餌料細胞密度的測量及對幼蟲胃飽滿程度的觀察，以幼蟲胃飽滿時水中餌料細胞密度達到1×104cells/mL左右為標準，確定了不同幼蟲生長階段的餌料適宜日投喂量。

4 結論

本研究中通過一系列的對比試驗，根據餌料品種及餌料配比對幼蟲生長及變態率等的影響進行了分析，首次總結形成了單環刺螠幼蟲培育的最佳餌料系列和最佳投喂方案，并確定了幼蟲培育適宜的餌料投喂量，為單環刺螠規模化苗種繁育生產奠定了基礎。

1)單一餌料投喂時，小球藻是單環刺螠幼蟲培育較好的開口餌料。

2)混合餌料投喂時，小球藻+球等邊金藻+酵母粉的餌料組合對單環刺螠幼蟲培育效果最佳。

3)綜合考慮成活率和變態率情況，單環刺螠幼蟲培育的最佳餌料投喂方案為，將小球藻、球等鞭金藻、酵母粉3種餌料按照2∶1∶1比例混合，在擔輪幼蟲前期只投喂小球藻+球等鞭金藻，至擔輪幼蟲中后期增加投喂酵母粉。

4)不同發育階段幼蟲的適宜投喂量確定為:初孵擔輪幼蟲期餌料日投喂量為2×104cells/mL，隨著幼蟲發育餌料投喂量逐漸增加，當出現蠕蟲狀幼蟲時日投喂量應增加至10×104～12×104cells/mL。