基于響應面法的維氏氣單胞菌滅活疫苗菌液發酵工藝優化及免疫效力比較

孫承文，賴迎迢,2，鞏華,2，任燕,2，江小燕，陳總會，黃志斌,2，陶家發,2*

(1.中國水產科學研究院 珠江水產研究所，廣東 廣州 510380；2.農業農村部漁藥創制重點實驗室，廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣東 廣州 510380)

細菌性敗血癥是淡水魚類養殖過程最常見的細菌性疾病之一，該病主要病原菌為氣單胞菌屬Aeromonas[1]，其中，維氏氣單胞菌Aeromonasveronii是近年來感染魚類的主要病原菌之一。每年的夏秋等高溫季節是該病暴發的高峰時期，一些重要的養殖經濟魚類品種如草魚Ctenopharyngodonidellus、鯽Carassiusaumtus、鳙Aristichthysnobilis、羅非魚Oreochromismossambicus、鲇Silurussoldatovi等均有暴發此類疾病的報道[2-6]，該病常常造成養殖魚類大規模發病死亡，給養殖戶帶來巨大的經濟損失。

目前，諸多學者對多種魚類進行了維氏氣單胞菌疫苗免疫研究，并已取得了較好的預防效果[7-10]，充分證明疫苗免疫對預防由維氏氣單胞菌感染引起的細菌性敗血癥具有良好效用。因此，推進維氏氣單胞菌疫苗的商品化、產業化進程，對于水產養殖業的健康發展和水產品安全具有十分重要的意義。

微生物發酵過程中液體培養基的組成、用量配比及發酵過程中接種量、溫度、pH、轉速等參數控制對微生物繁殖及代謝產物的累積均有直接的影響[11-14]。因此，若要提高微生物發酵的產量，在篩選出適宜發酵的培養基組成的同時，也需要對發酵的工藝參數進行優化。本研究中，通過單因素試驗和響應面分析對維氏氣單胞菌滅活疫苗的發酵參數進行優化，并比較了不同發酵條件對發酵菌液制備的滅活疫苗的安全性、免疫效力的影響，從而促使維氏氣單胞菌滅活疫苗菌液活菌數增加產量并節約成本，旨在為產業化維氏氣單胞菌滅活疫苗生產工藝提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

取健康異育銀鯽Carassiusauratus600尾(體質量12～16 g)于水泥池中暫養，水溫27～29 ℃的水環境下飼養7 d以上，用于后續安全性試驗、免疫試驗。

維氏氣單胞菌LY02，由中國水產科學研究院珠江水產研究所從患細菌性敗血病鰱Hypophthalmichthysmolitrix腎臟中分離、鑒定和保存。

基礎培養基(營養肉湯培養基NB)：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L和氯化鈉5.0 g/L，固體培養基另加瓊脂18.0 g/L。

發酵培養基：蛋白胨10.8 g/L、牛肉膏5.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L和氯化鈉5.0 g/L。

儀器：恒溫搖床(ZWY-211B，上海智誠分析儀器制造有限公司)、紫外分光光度計(UV1800PC，上海奧析科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 二級種子液制備 將維氏氣單胞菌CA07菌種用營養肉湯培養基溶解后，劃線接種于營養瓊脂平板，28 ℃下培養 24 h，挑取典型菌落接種于含營養肉湯液體培養基中，于28 ℃條件下震蕩培養18～20 h，作為一級種子液。

1.2.2 單因素試驗 配制發酵培養基分裝于三角瓶(300 mL/瓶)中，分別接種一級種子液，進行單因素試驗時，其他發酵條件(接種量10%、培養基初始濃度7.5、溫度31 ℃、轉速200 r/min)保持不變，分別考察接種量(1%、5%、10%、15%、20%，均為體積分數，下同)、培養基初始pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)、溫度(25、28、31、34、37 ℃)和轉速(160、180、200、220、240 r/min)等發酵參數對維氏氣單胞菌CA07生長的影響，得出最佳參數對活菌數的影響。

綜上所述，DM/PM及早診斷是獲得良好預后的關鍵。對于ILD疑似炎性肌肉病者，應密切隨訪、完善免疫學相關檢查、及早治療，以期延緩肺纖維化進展，尤其應避免感染的發生發展，進而誘發ARDS等，改善患者生活質量，提高生存率。

1.2.3 響應面試驗對發酵培養基的優化 結合單因素試驗結果，利用響應面Box-Behnken試驗，設計溫度、培養基初始pH、轉速3因素3水平響應面試驗方案，采用 Design Expert 12.0 軟件進行響應面分析。

1.2.4 優化后發酵工藝驗證試驗 在響應面法優化的發酵條件下進行發酵試驗，通過比較預測值和試驗值驗證模型的有效性。用優化后的發酵工藝，采用三角瓶發酵培養維氏氣單胞菌CA07，培養結束后測定維氏氣單胞菌CA07菌的活菌數。

1.2.5 安全性及免疫效力比較試驗 篩選響應面試驗中活菌數最低量組(L)、中位量組的發酵菌液(M)及優化后的驗證試驗發酵菌液組(H)分別添加甲醛溶液(甲醛溶液終體積分數為0.30%)，37 ℃下滅活24 h制備滅活疫苗。將制備的滅活疫苗分為原液組、稀釋組(原液組以滅菌生理鹽水稀釋)備用。

1)安全性試驗。取健康鯽120 尾，隨機分為4 組，每組30 尾。3個免疫組(L、M、H組)腹腔分別注射滅活菌液0.20 mL/尾，1個對照組腹腔注射生理鹽水0.20 mL/尾，觀察14 d，每日記錄各組魚的死亡數。

2)免疫效力比較試驗。取健康鯽210 尾，隨機分為7組，每組30 尾。6個免疫組(L、M、H原液組及L、M、H稀釋組)腹腔分別注射滅活菌液0.20 mL/尾，1個對照組腹腔注射生理鹽水0.20 mL/尾。免疫28 d后，免疫組和對照組各腹腔注射維氏氣單胞菌CA07株菌液進行攻毒，攻毒后觀察7 d，每日記錄各組魚的死亡數，比較不同發酵條件下CA07株疫苗的免疫效果。

取健康鯽120 尾，隨機分為4 組，每組30 尾。2個免疫組腹腔分別注射CA07滅活菌液0.20 mL/尾(滅活前菌液活菌數約4.0×109CFU/mL)，2個對照組腹腔分別注射生理鹽水0.20 mL/尾。免疫28 d后，免疫組和對照組分別以CA07株菌液、LY02株菌液進行攻毒，攻毒后觀察7 d，每日記錄各組魚的死亡數，比較維氏氣單胞菌不同菌株對CA07株疫苗的免疫交叉保護效果。疫苗相對免疫保護率(RPS,%)計算公式為

RPS=(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)× 100%。

1.3 數據處理

單因素試驗數據采用用SPSS 17軟件進行統計和差異顯著性分析，響應面試驗數據采用 Design Expert 12.0 軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 接種量對維氏氣單胞菌CA07生長的影響

從圖1可見：維氏氣單胞菌CA07在接種量為1%時，培養后活菌數最低，隨著接種量體積的增加，活菌數也隨之升高；當接種量提升為5%時，培養后活菌數最高(5.50×109CFU/mL)，活菌數增加顯著(P<0.05)，之后隨著接種量的增加活菌數略有下降。考慮到規模化生產過程中節約成本等要求，因此，選擇5%為最佳接種量。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。

2.2 培養基初始pH對維氏氣單胞菌CA07生長的影響

從圖2可見：發酵培養基中初始pH對維氏氣單胞菌CA07菌液的濃度影響較大，當初始pH為6.5～8.5時，隨著pH增大，維氏氣單胞菌CA07菌液的活菌數呈先增加后減少的趨勢；當初始pH為7.5時，活菌數達到最大(5.67×109CFU/mL)，活菌數增加顯著(P<0.05)。這表明，過酸或偏堿性條件下會抑制該菌的生長。因此，選擇7.5為最佳培養基初始pH。

圖2 不同pH對維氏氣單胞菌CA07株生長的影響

2.3 溫度對維氏氣單胞菌CA07生長的影響

從圖3可見：25 ℃時菌體生長較緩慢，發酵溫度上升為28 ℃時活菌數顯著提高(P<0.05)，活菌數達到最大(6.07×109CFU/mL)；當溫度升高至31 ℃時，活菌數開始下降。因此，選擇28 ℃為最佳發酵溫度。

圖3 不同溫度對維氏氣單胞菌CA07株生長的影響

2.4 轉速對維氏氣單胞菌CA07生長的影響

從圖4可見：當轉速從160 r/min升至220 r/min時，維氏氣單胞菌CA07發酵活菌數呈上升趨勢；當轉速達到220 r/min時，活菌數達最高(9.23×109CFU/mL)活菌數增加顯著(P<0.05)；當轉速達到240 r/min時，發酵菌液活菌數呈下降趨勢。因此，選擇220 r/min為最佳發酵轉速。

圖4 不同轉速對維氏氣單胞菌CA07株生長的影響

2.5 響應面優化試驗

2.5.1 響應面優化試驗設計及結果 根據單因素試驗結果，選取溫度(A)、pH(B)和轉速(C)3個因素進行響應面優化設計(表1)，以活菌數(Y)為響應值進行試驗，維氏氣單胞菌培養菌液Box-Behnken 試驗結果如表2所示。

表1 響應面試驗設計因素與水平

2.5.2 模型建立與方差分析 利用Design Expert 8.0軟件對表2的結果進行回歸分析，得到活菌數回歸方程為

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果

Y=10.72+0.32A+0.13B+0.68C-0.02AB-0.12AC-0.03BC-1.90A2-1.83B2-1.10C2。

對回歸方程進行方差分析顯示：模型P<0.001，表明此模型達到極顯著水平；回歸方程中溫度、轉速的一次項達到了顯著的水平(P<0.05)，說明在試驗范圍內這兩個因素對活菌數的積累有顯著性影響；在交叉項中，溫度、pH、轉速三者的交互作用對活菌數無顯著性影響(P>0.05)；二次項中，溫度、pH、轉速三者對活菌數的積累均有極顯著性影響(P<0.001)(表3)。

表3 響應面模型方差分析

2.5.3 響應面圖分析 各因素交互作用對菌株發酵活菌數結果的影響見圖5。若響應面曲面圖的傾斜坡度陡峭，表明發酵條件的變化對響應值(活菌數)的影響顯著；如果響應面曲面圖的傾斜坡度相對平緩，則表明發酵條件的變化對響應值(活菌數)的影響不敏感。由圖5可知，隨著3個因素水平的逐漸增高，活菌數值呈先增后降的趨勢，交互作用的3個響應面均出現極大值。

等高線的形狀可反映出交互作用的顯著性，等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著，等高線呈圓形表示交互作用不顯著，因此，可以通過等高線圖直觀觀察到A與B、A與C和B與C間相互作用的重要性。圖5中，A(溫度)、B(pH)、C(轉速)均對響應指標(活菌數)有顯著影響，其中AC(溫度與轉速)、BC(pH與轉速)的交互作用相對較強，對活菌數的影響相對較大，呈現較大角度的橢圓形，而AB(溫度與pH)次之，橢圓形的角度相對較小。以上結果與響應面二次模型的方差分析結果一致。

圖5 各因素交互作用對活菌數影響的響應面

2.6 驗證試驗

根據響應面分析預測的最佳培養條件為溫度28.22 ℃、pH 7.52、轉速226.14 r/min，在此條件下預測的活菌數最大值為10.84×109CFU/mL。為了驗證模型預測的準確性，依據響應面試驗優化得到的發酵條件，為方便操作，將上述發酵條件設定為溫度28 ℃、pH 7.5、轉速230 r/min，并進行驗證性試驗，得到活菌數為11.13×109CFU/mL，較單因素試驗最高活菌數值(9.23×109CFU/mL)提高20.59%，與預測值基本相符。

2.7 發酵菌液滅活疫苗安全性試驗

選取響應面試驗結果中活菌數最低量2#組(L)、中位量8#組(M)及優化組(H)菌液進行疫苗安全性試驗，結果顯示，各試驗組滅活疫苗注射魚及對照組試驗魚均全部健活，免疫魚未出現臨床癥狀，攝食、游姿及體色均正常，注射部位無紅腫，內臟器官無病變(表4)，表明不同發酵條件下，發酵菌液制備的滅活疫苗安全性良好。

表4 不同發酵條件下菌液制備的疫苗安全性比較

2.8 發酵菌液滅活疫苗免疫效力的比較

對原液組、稀釋組免疫后用CA07菌液進行攻毒試驗，免疫結果顯示：原液試驗組相對免疫保護率在90%以上，隨著疫苗活菌數增加，保護率可達到100%，表明優化發酵條件可提高發酵菌液制備滅活疫苗的活菌數，從而顯著提高疫苗的相對保護率；稀釋試驗組中優化發酵菌液的滅活疫苗經過3倍稀釋，相對免疫保護率仍然可以達到70%以上，不同發酵條件對疫苗的免疫效果未產生不利影響，這表明，通過優化發酵條件可以獲得更高活菌數的菌液，在達到疫苗免疫效果要求的前提下，通過稀釋可以顯著節約成本，獲得更高產量(表5)。

表5 不同發酵條件下菌液制備的疫苗免疫效力比較

進一步通過試驗對比維氏氣單胞菌疫苗菌株CA07株與LY02株的交叉免疫效果，結果顯示，CA07株對LY02株的相對保護率在42.31%，表明疫苗菌株CA07株與LY02株間存在一定的交叉保護作用(表6)。

表6 CA07株菌液制備的疫苗與LY02株交叉免疫效力比較

3 討論

3.1 單因素試驗

本研究中通過考察不同轉速、溫度、培養基初始pH和接種量對維氏氣單胞菌CA07株發酵菌液活菌數的影響，結果表明，溫度、轉速、培養基初始pH較接種量對發酵菌液活菌數的影響更明顯，這3個因素可以作為響應面考察因子進一步研究。相關研究中，張曉青等[15]通過單因素試驗考察不同的轉速、溫度、初始pH和接種量對紅球菌SY095發酵液表面張力的影響，通過單因素試驗結果比較，選取轉速、溫度、初始pH作為響應面試驗考察因子。韓旭東等[16]考察不同的發酵溫度、培養基pH、接種量和發酵時間對芽孢桿菌ZYCHH-01發酵生產抑菌物質的影響，通過對單因素試驗結果比較，選取了以發酵溫度、培養基pH、發酵時間作為響應面試驗考察因子。

3.2 響應面分析

目前，單因素法、正交試驗法、響應面優化法已廣泛應用于生產實踐及對微生物發酵條件優化的科學研究中。其中，單因素法、正交試驗法存在一些缺陷，如忽略了因素間的交互作用，無法找到整個區域的最優值等；而響應面優化法得到的數據更精確、更全面，對試驗有顯著影響的因素都可以用響應面優化法進行優化，在微生物發酵條件的優化中越來越多的應用[17]。有研究表明，通過響應面法優化后驗證實測的結果與理論預測值接近，李書穎等[18]使用單因素試驗和響應面法對解淀粉芽孢桿菌發酵參數進行優化，在優化條件下測定的OD600 nm平均值為1.747，與模型預測值相對誤差約為1%。張安寧等[19]在香菇液態發酵單因素試驗基礎上，通過響應面法對發酵條件進行優化試驗，按照最佳條件培養，菌絲生物量實測值為17.76 g/L，與理論值17.58 g/L相差1.02%。也有研究表明，響應面法優化后驗證實測的結果較優化前增加顯著，如王垚等[20]通過響應面法優化一株產纖維素酶嗜鹽真菌產酶條件，優化后，纖維素酶活力由113.3 U/mL提高到302.8 U/mL，提高了167%；冒鑫哲等[21]通過單因素試驗和響應面優化枯草芽孢桿菌工程菌產角蛋白酶發酵條件，優化后，搖瓶發酵24 h 角蛋白酶活性達到260 480 U/mL，較優化前提高了4.26 倍。韓學易等[22]利用響應面分析法(RSM)對基因工程菌WH320-pHIS1525-G7產纖維素酶發酵條件進行優化，優化發酵條件下測得纖維素酶活力為2.152 U/mL，比優化前搖瓶發酵酶活力提高了2倍。

本研究中，首先采用單因素試驗方法確定出溫度、培養基初始pH與轉速為關鍵因素，然后通過響應面Box-Behnken試驗分析確定出關鍵因素的最佳值，得到的最佳發酵工藝條件為溫度28 ℃、pH 7.5、轉速230 r/min，在此優化發酵條件下，試驗得到的活菌數最大值為11.13×109CFU/mL，較單因素試驗最高活菌數值提高20.59%，與預測值基本相符。響應面Box-Behnken試驗方法可以建立變量曲面模型和回歸方程，根據響應面曲面圖的傾斜坡度、等高線的形狀，能夠快速、有效地從發酵條件中篩選出影響活菌數的關鍵因素，并實現其優化得到最佳的發酵工藝條件，說明回歸方程可較真實地反映各篩選因素的影響，同時證明用響應面法來尋找維氏氣單胞菌的最佳發酵工藝條件是可行、有效的。

3.3 不同發酵條件對疫苗免疫效力的影響

本研究中，通過對比不同發酵條件下菌液制備維氏氣單胞菌CA07株滅活疫苗的安全性試驗，結果表明，發酵條件對維氏氣單胞菌CA07株滅活疫苗的安全性無影響。在免疫效力方面，不同發酵條件下制備的疫苗，原液組隨著活菌數的提高，相對免疫保護率也顯著增加。稀釋組免疫鯽，優化組即使稀釋3倍，相對免疫保護率也達到70%以上。優化后發酵條件下可以獲得更高濃度的活菌數，且制備疫苗可以顯著節約成本，提高產量。維氏氣單胞菌CA07株滅活疫苗免疫鯽后，以鰱源維氏氣單胞菌LY02株攻毒，相對免疫保護率達42.31%，表明該菌株與LY02株具有較強的交叉免疫保護作用。

4 結論

1)通過單因素試驗、響應面法優化維氏氣單胞菌菌液發酵工藝，初步建立維氏氣單胞菌滅活疫苗菌液發酵參數，即溫度為28 ℃，pH為7.5，轉速為230 r/min，接種量為5%，在此工藝下發酵的菌液活菌數達11.13×109CFU/mL，較單因素試驗最高活菌產量顯著提高20.59%。

2)通過優化發酵工藝發酵菌液制備的滅活疫苗安全性良好，相對免疫保護率達到70%以上，與LY02株交叉免疫保護率達42.31%。