桂花提取物中黃酮類化合物的成分鑒定

李育林，蔡秋瑩，湯曉月，周林樺，任冬霞，呂凡，李云*

（1.四川大學華西公共衛生學院，華西第四醫院，四川 成都 610041；2.四川大學華西醫院，四川 成都 610041）

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）為木犀科（Oleaceae）木犀屬植物，又名九里香、山桂、金栗等。在傳統飲食文化中，桂花被添加到酒[1-2]、茶[3]以及糕點中用以增加食品風味。桂花作為我國特有的珍貴純天然香料，從中提取的桂花露[4]、桂花浸膏及精油[5-6]被應用到化妝品和香水的生產。

黃酮類化合物作為一種次級代謝產物[7]，存在于大多數的水果、蔬菜、茶以及眾多植物的根莖葉及花中。眾多研究表明，黃酮類化合物具有抑制自由基的氧化反應、降低腫瘤及心腦血管疾病發生風險等多種生理功能[8-10]。劉哲慧等[11]對水芹總黃酮的研究表明，對于由雞紅細胞引起的小鼠血清中的溶血素水平下降，水芹總黃酮具有一定的提高作用。諸多研究證明，桂花提取物具有抗氧化、抑菌、降血糖、鎮痛抗炎等生理功能[12-15]。李姍憶等[16]從日香桂根莖中分離得到一個新的化學成分（GH-0521），二甲苯耳廓腫脹實驗和醋酸扭體實驗的結果表明該化學成分具有一定的抗炎鎮痛作用。黃酮類化合物是一種天然的免疫調節劑，可以促進脾淋巴細胞的增殖和增強遲發型變態反應從而增強細胞免疫功能[17]，提高抗體效價[18]，使免疫器官指數增加，增強非特異性免疫[19]，改善機體免疫系統。曹柏營等[20]研究發現藤本豆豆莢總黃酮表現出呈劑量依賴性的增強巨噬細胞系統活性的能力，對小鼠的非特異性免疫具有免疫增強作用。本課題組前期對桂花提取物中黃酮類化合物的體內外抗氧化活性進行了研究[21]，未涉及黃酮類化合物的定性研究。本文對桂花提取物中黃酮類化合物進行成分鑒定，為桂花資源的進一步開發利用提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）：品種為日香桂，采摘于成都市溫江區萬畝桂花產業園；桂花提取物osthin：由四川大學華西藥學院黃靜教授課題組提供，常溫（25℃）下呈半固體，保存于-20℃冰箱。

無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；蘆丁（純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；硝酸鋁（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；甲醇、乙酸、乙腈（色譜純）：德國CNW公司。

1.2 儀器與設備

XA-1型高速萬能粉碎機：江蘇姜堰市銀河實驗儀器廠；HSY-SP電熱恒溫水浴箱：北京市永光明醫療器械廠；GZD-D400-BS-II電熱恒溫干燥箱：上海躍進醫療器械廠；BSA223S電子天平：德國Sartorius公司；EV311旋轉蒸發儀：北京萊伯泰科儀器有限公司；Multiskan GO自動酶標讀數儀：美國Thermo Fisher科技有限公司；索氏提取器：四川蜀玻有限公司；TGL-16MS臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；TYXH-I漩渦振蕩器：上海汗諾儀器有限公司；Xevo G2-XS QTof高分辨質譜儀、ACQUITY UPLC高效液相色譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）：Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 桂花提取物的提取

新鮮桂花采摘后立即在80℃下烘干，粉碎，過40目篩，常溫（25℃）避光保存。采用乙醇回流法提取，提取條件：按料液比1∶40（g/mL）加入濃度為80%的乙醇，回流提取時間為3 h，提取溫度為70℃。所得提取液在旋轉蒸發儀中于65℃下旋轉蒸發乙醇后濃縮，使用0.45 μm的微孔濾膜過濾，得桂花提取物。

1.3.2 桂花提取物中黃酮類化合物含量的測定

準確稱取蘆丁標準品20 mg，30%乙醇溶解，配制成濃度為0.1 mg/mL的標準溶液，備用。分別取上述蘆丁標準溶液 0、1、2、3、4、5 mL 加入到 10 mL 的容量瓶，各加入0.4 mL的5%NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min后加入10%Al（NO3）3溶液0.4 mL，混勻，靜置6 min；最后加入4%NaOH溶液4 mL，混勻，用30%乙醇定容，搖勻，10 min后在波長510 nm處測定吸光度。橫坐標（X）為蘆丁標準溶液的濃度，縱坐標（Y）為吸光度A，繪制標準曲線，并得到回歸方程。

取桂花提取物原液、10倍稀釋液、20倍稀釋液和50倍稀釋液各1 mL置于10 mL容量瓶中，按照上述繪制標準曲線的方法，測定其吸光度，選擇吸光度在上述標準曲線吸光度A范圍內的樣品，按照回歸方程計算出桂花提取物中黃酮類化合物的含量。

1.3.3 桂花提取物中黃酮類化合物的成分鑒定

1.3.3.1 預處理過程

將桂花提取物離心 10 min（13 000 r/min，4 ℃），用注射器吸取200 μL上清液，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉移到進樣小瓶，-80℃下保存。

稱取15 mg桂花提取物osthin，加入1 mL的甲醇：水（7∶3，體積比），加入兩個小鋼珠，在-20℃放置 2 min預冷，放入研磨機（60Hz，2min），超聲輔助提取 30 min，-20℃靜置20 min后，離心10 min（13 000 r/min，4℃），用注射器吸取200 μL的上清液，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉移到液相色譜（liquid chromatography，LC）進樣小瓶，-80℃下保存。

1.3.3.2 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈。洗脫梯度見表1。流速0.4 mL/min，柱溫45℃，進樣體積 2 μL。

表1 洗脫梯度Table 1 Elution gradient

1.3.3.3 質譜條件

離子源是電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式。質譜參數為毛細管電壓+3、-2 kV，樣品錐孔電壓40 V，源偏移電壓80 V，源溫度120℃，脫溶劑溫度450℃，脫溶劑氣體流速800 L/h，錐孔氣流速50 L/h，質量掃描范圍m/z50～100。

1.3.3.4 數據處理及結果判定

原始數據的采集使用UNIFI1.8.1軟件。在進行模式識別之前，原始數據經Progenesis QI v2.3軟件（Nonlinear Dynamics Newcastle UK）進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化，其主要參數為母離子質量偏差5ppm；子離子質量偏差10ppm；子離子強度偏差閾值5%。將正負離子數據合并成一個數據矩陣表。化合物的鑒定基于精確質量數、二級碎片以及同位素分布，使用 The Human Metabolome Database（HMDB）、Lipidmaps（v2.3）和METLIN數據庫進行定性。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

根據蘆丁的濃度和吸光度繪制的標準曲線見圖1，得到濃度和吸光度的回歸方程為Y=0.347X+0.045 8，（R2=0.999）。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 桂花提取物中黃酮類化合物的濃度

桂花提取物10倍稀釋液的吸光度為0.17，通過回歸方程得出桂花提取物中黃酮類化合物的濃度為3.58 mg/mL。

2.3 桂花提取物中黃酮類化合物的成分鑒定

基峰圖（base peak chromatogram，BPC）是將每個時間點質譜圖中最強離子的強度連續描繪得到的圖譜。桂花提取物正負離子模式的BPC見圖2和圖3，桂花提取物中黃酮類化合物數據信息詳見表2。

表2 桂花提取物中黃酮類化合物數據信息Table 2 Data information table of flavonoids in Osmanthus fragrans Lour.extract

圖2 桂花提取物正離子模式的BPC圖Fig.2 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract in positive ion mode

圖3 桂花提取物負離子模式的BPC圖Fig.3 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract negative ion mode

由圖2、圖3和表2可知，通過與HMDB、Lipidmaps（v2.3）和METLIN數據庫的對比，將所測物質的理論質荷比（m/z）與實際測得的該物質的質荷比進行比較，得分＞40分，一般為此類化合物。可能的黃酮類化合物有358種，表2列出了得分在前10的黃酮類化合物數據信息，桂花提取物中miconioside B、egonol gentiobiosidev、camellianin A得分較高。

桂花提取物osthin正負離子模式的BPC見圖4和圖5。桂花提取物osthin中黃酮類化合物數據信息詳見表3。

圖4 桂花提取物osthin正離子模式的BPC圖Fig.4 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract osthin positive ion mode

圖5 桂花提取物osthin負離子模式的BPC圖Fig.5 BPC diagram of Osmanthus fragrans Lour.extract osthin negative ion mode

表3 桂花提取物osthin中黃酮類化合物數據信息Table 3 Data information sheet of flavonoids in osmanthus extract osthin

由圖4、圖5和表3可知，通過與HMDB、Lipidmaps（v2.3）和METLIN數據庫的對比，將所測物質的理論質荷比（m/z）與實際測得的該物質的質荷比進行比較，得分＞40分，一般為此類化合物。桂花提取物osthin中可能的黃酮類化合物有232種，表3列出了得分在前10的黃酮類化合物數據信息，桂花提取物osthin 中 miconioside B、negletein 6-[rhamnosyl-（1->2）-fucoside]、kenusanone J黃酮類化合物得分較高。

3 結論

分光光度法測得桂花提取物中黃酮類化合物的濃度為3.58 mg/mL。LC-MS的檢驗結果表明桂花提取物中有 miconioside B、egonol gentiobioside、camellianin A等黃酮類化合物的存在，桂花提取物osthin中有miconioside B、negletein 6-[rhamnosyl-（1->2）-fucoside]、kenusanone J等黃酮類化合物的存在。本研究通過對桂花提取物中黃酮類化合物進行成分鑒定，為其以后在桂花資源的開發利用、桂花提取物中黃酮類化合物的分離純化、結構鑒定和含量測定等方面的研究提供理論依據。