釀酒酵母與球擬酵母混合發酵對白酒風味物質的影響

周鈺涵，崔丹瑤，閆昕，林良才，張翠英

（省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

白酒是我國著名的蒸餾酒，其主要成分包括水、乙醇及微量風味物質。白酒中的風味物質占比雖然只有2%～3%，但卻決定了白酒的香型與品質。白酒的風味物質包括酯類、醇類、酸類、醛類、縮醛類、酮類、酚類、吡嗪類等，其中酯類物質是占比最大的香味物質，包括乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯[1]。乙酸乙酯能夠提供果香氣味，是白酒中最常見的風味物質之一，同時也是清香型白酒的主體風味物質，在清香型白酒中一般具有較高的含量[2]。

白酒中乙酸乙酯的合成途徑主要分為化學合成和生物合成[3]。化學合成是指乙醇和乙酸的化學反應，生成的乙酸乙酯含量較少且生成速度較慢。生物合成是指酒曲微生物中的酶利用原料中的營養成分，通過自身的代謝途徑進行產酯，是白酒乙酸乙酯的主要來源[4]。白酒中的功能性微生物主要包括酵母菌、細菌、霉菌等[5-6]。球擬酵母（Torulopsis globosa）屬于非釀酒酵母（non-Saccharomyces），具有良好的產酯能力，是白酒生產應用中最廣泛的生香酵母之一。包括球擬酵母在內的大部分生香酵母所產的酯類生香物質都是乙酸乙酯，也有少量酵母產己酸乙酯、丁酸乙酯[7]。邢爽等[8]證明了在自然pH值條件下，球擬酵母的產酯能力要優于卡特多菲畢赤酵母、克魯斯假絲酵母和漢遜酵母，酯分解能力要比其他產酯酵母低。呂磊等[9]發現在相同的培養條件下，發酵過程中的球擬酵母的總生物量要高于異漢遜酵母、釀酒酵母和意大利酵母。

如何有效提高白酒中乙酸乙酯含量，提高白酒品質一直是研究熱點之一。吳軒德等[10]證明了釀酒酵母與巴氏醋桿菌混合發酵時，同步接種能夠顯著提高乙酸乙酯生成量。唐潔等[11]證明了釀酒酵母與異常畢赤酵母兩種菌株混合發酵時，不僅能生成更多的酯類物質，還有效降低了總酸和高級醇的含量。

前期通過分子生物學方法，選育出了一株高產乙酸乙酯，同時產乙醇能力不變的釀酒酵母菌株[12-13]。張華東等[14]將醋酸菌的菌懸液添加到高產酯釀酒酵母菌懸液中，乙酸乙酯含量提高了12%。高產酯釀酒酵母與球擬酵母都具有高產乙酸乙酯的能力，但二者在白酒發酵過程中的相互作用尚不明確。本研究將工業釀酒酵母、高產酯釀酒酵母分別以不同接種體積比、不同接種順序與球擬酵母進行混合發酵，研究球擬酵母對這兩株酵母的影響，揭示球擬酵母對高產酯釀酒酵母產酯能力的強化作用，為高產酯釀酒酵母在清香型白酒發酵中的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

工業釀酒酵母菌株AY15、高產酯釀酒酵母菌株MY15、球擬酵母WY2：天津市工業微生物重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

玉米粉、高粱粉：市售；酵母膏（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；葡萄糖（分析純）：天津光復精細化工有限公司；乙酸乙酯、乙酸異戊酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；耐高溫淀粉酶（2.9×105U/mL）、糖化酶（1×105U/mL）：諾維信生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

1）酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone eextrose medium,YEPD）：10 g蛋白胨、10 g葡萄糖、5 g酵母浸粉，定容至500 mL，自然pH值，固體培養基添加2%瓊脂粉，115℃滅菌20 min。

2）酵母種子培養基：首先將500g玉米粉與1500 mL溫水按料液比 1∶3（g/mL）混合，60 ℃處理 20 min。然后加入耐高溫淀粉酶（20 U/g原料），90℃水浴處理1.5 h，降溫并轉移至60℃水浴鍋中，加入糖化酶（200 U/g原料）處理20 h。將水解液過濾后，調整糖度至8°Bx與12°Bx，分別為一級種子培養基與二級種子培養基。最后在種子培養基中加入0.5%酵母浸粉，105℃滅菌20 min。

3）高粱半固態發酵培養基：稱取80 g高粱粉放置于500 mL錐形瓶中，加入熱水200 mL，加入耐高溫淀粉酶（20 U/g原料），90℃水浴處理1 h。將培養基121℃滅菌20 min，隨后迅速冷卻至60℃，加入糖化酶（200 U/g原料）水浴30 min。

1.2 儀器與設備

GC 7890B氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；MS204S電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；XMTB型電熱恒溫水浴鍋：天津市中環實驗器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱半固態發酵接種方式

首先挑取酵母菌株一環，接種至裝有5 mL一級種子培養基的試管中，30℃靜置培養24 h。將一級種子液傾倒至裝有45 mL二級種子培養基的錐形瓶中，8層紗布封口后，30℃靜置培養16 h，確保二級種子液中的細胞數達到5×106CFU/mL。將釀酒酵母工業菌株AY15和高產酯釀酒酵母菌株MY15以同步接種和順序接種的方式，分別與球擬酵母進行混合發酵試驗。

1）同步接種：釀酒酵母與球擬酵母分別按照1∶1、1:2、2:1的不同體積比接種，將二級種子液同時接種到高粱半固態培養基中 （A∶W=1∶1、1∶2、2∶1 分別代表AY15 與 WY2 以 1∶1、1∶2、2∶1 的接種體積比進行發酵；M∶W=1∶1、1∶2、2∶1 分別代表 MY15 與 WY2 以 1∶1、1∶2、2∶1的接種體積比進行發酵）。

2）順序接種：先將釀酒酵母或球擬酵母中的一種接種于高粱半固態培養基中，靜置培養1 d后，再接種相同數量的另一種酵母（AW和MW分別代表先接種AY15或MY15，發酵1 d后再接種WY2；WA和WM分別代表先接種WY2，發酵1 d后再接種AY15與MY15）。

接種后將錐形瓶靜置于30℃培養箱中，每隔12 h檢測CO2失重，失重小于0.5 g時視為發酵終止，對發酵液進行蒸餾，檢測風味物質生成量。

1.3.2 風味物質生成量的檢測

乙酸酯及高級醇等微量風味物質通過氣相色譜進行檢測。氣相色譜儀的色譜柱采用AgilentHP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm），載氣為高純氮氣，柱流速為0.8 mL/min，進樣口溫度200℃，檢測器溫度150℃。升溫程序：起始溫度50℃，保持8 min，以5℃/min升至150 ℃，保持 15 min；分流進樣，分流比為 10∶1。

1.3.3 分析方法

釀酒酵母和球擬酵母采用血球計數板的方法進行計數；CO2釋放量采用稱重法；發酵液中剩余還原糖含量采用斐林試劑法[15]；酒精度的測定采用酒精計比重法。

1.4 數據處理

采用Origin 8.5軟件對數據進行作圖分析，數據代表3個獨立重復數據的平均值和標準差，統計學分析由SPSS 19.0軟件處理。

2 結果與分析

2.1 單菌發酵對風味物質的影響

利用釀酒酵母菌株AY15、高產酯酵母MY15與球擬酵母WY2進行單菌發酵，發酵過程中的CO2總失重、酒精度、發酵周期和發酵液中剩余還原糖含量如表1所示。

表1 菌株單獨發酵對發酵特征的影響Table 1 Effect of separate fermentation of strain on fermentation characteristics

由表1可知，3株菌株純種發酵時，CO2總失重在26.1 g～26.2 g之間，酒精度均為9.4%vol，均無明顯差異。但是AY15和MY15的發酵周期為5 d，而球擬酵母則需要7 d才能完成發酵過程。

白酒香味成分有醇類、酯類、酸類和醛類等，每種成分都對白酒的風味有不同的貢獻[16-17]。本試驗檢測了酒樣中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇的含量，結果如圖1所示。

圖1 菌株單獨發酵對乙酸酯和高級醇生成量的影響Fig.1 The impact of single fermentation on acetate ester production

由圖1可知，當3株菌株進行純種發酵時，釀酒酵母MY15的乙酸乙酯生成量為275.19 mg/L，是野生型菌株AY15的22.3倍，證明醇乙酰基轉移酶編碼基因ATF1的過表達使產酯能力得到了大幅度的提高。球擬酵母WY2的乙酸乙酯生成量為116.93 mg/L，同樣具有較強的乙酸乙酯生成能力。釀酒酵母MY15純種發酵時生成了35.16 mg/L的乙酸異戊酯；釀酒酵母AY15和球擬酵母WY2純種發酵時未檢測到乙酸異戊酯，這可能是由于酒樣中含量過低導致氣相色譜無法檢測出。

球擬酵母WY2的正丙醇和異丁醇生成量分別為24.65 mg/L和124.08 mg/L，比釀酒酵母AY15的正丙醇和異丁醇生成量分別提高了1.76倍和2.48倍；異戊醇和苯乙醇的生成量為189.71 mg/L和60.96 mg/L，與菌株AY15單獨發酵相比分別降低了19.07%和42.15%。由于高產酯釀酒酵母MY15中的支鏈氨基酸轉氨酶編碼基因BAT2被敲除，阻斷了氨基酸生成α-酮酸的轉氨過程，導致異丁醇與異戊醇低于釀酒酵母AY15。

2.2 不同接種體積比對混合發酵的影響

2.2.1 發酵性能理化指標分析

以不同接種體積比進行混合發酵，發酵性能相關指標如表2所示。

表2 不同接種體積比對發酵特征的影響Table 2 The impact of fermentation performance by different inoculation proportion

由表2可知，當釀酒酵母與球擬酵母以不同體積比接種進行發酵時，發酵周期由5 d縮短為4 d。6個試驗組的CO2總失重在26.9 g～27.8 g之間，酒精度在9.5%vol～9.7%vol之間，證明了不同接種體積比對CO2總失重和酒精度沒有顯著影響。

釀酒酵母與非釀酒酵母以同步接種的方式進行混合發酵時，釀酒酵母能夠優先利用碳源而迅速增殖，抑制非釀酒酵母的生長；非釀酒酵母可能會受到營養物質、乙醇、pH值、酵母代謝物等因素的影響，與釀酒酵母產生競爭抑制，影響發酵結果[10，18]。這種抑制效果的強弱與接種量的比例存在著密切的聯系，Fan等[19]將S.cerevisiae和W.anomalus以不同接種菌數比進行混合發酵，接種菌數比6∶1時還原糖消耗速度最慢、CO2釋放量最低；接種菌數比為 1∶1 和 1∶2 時，還原糖消耗量和CO2釋放量是相似的，其效果優于6∶1的接種菌數比。荊雄等[20]將檸檬形克勒克酵母（Klockera apiculata）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）與釀酒酵母分別進行了混合發酵，發酵前期非釀酒酵母和釀酒酵母會相互抑制，但并未影響最終的酒精度。在本研究中，將釀酒酵母AY15、MY15分別與球擬酵母 WY2 以 1∶1、1∶2、2∶1 的體積比接種，并進行發酵，發酵周期不僅沒有延長，與釀酒酵母純種發酵相比反而縮短至4 d。這可能是因為兩種酵母接種比例相差較小，接種至發酵培養基后雖然出現了競爭抑制，但并未影響整體的發酵進程。而兩種酵母的同時接種加快了混合發酵體系中還原糖被消耗的速度，這是發酵周期縮短的主要原因。

2.2.2 不同接種體積比對乙酸酯生成量的影響

發酵過程中非釀酒酵母的生長代謝可以提高原料的利用率、合成風味成分增加酒體的芳香，但釀酒酵母仍是發酵過程不可或缺的組分，將不同的非釀酒酵母與釀酒酵母進行組合，達到抑制其不良作用，發揮優良功能的目的[21]。釀酒酵母AY15和MY15分別與菌株 WY2 以不同體積比（1∶1、1∶2、2∶1）接種進行混合發酵對乙酸酯（乙酸乙酯和乙酸異戊酯）的提升效果如圖2所示。

圖2 不同接種體積比對乙酸酯生成量的影響Fig.2 The impact of different inoculation proportion on acetate ester production

由圖2可知，接種體積比為1∶2時生成的乙酸乙酯生成量分別為 75.96 mg/L（A∶W）和 351.65 mg/L（M∶W），明顯高于其他兩種接種體積比。這說明了釀酒酵母的接種量會影響球擬酵母的產酯能力。接種體積比為1∶2時，球擬酵母數量占優勢，減弱了釀酒酵母的抑制效果，促進了乙酸酯的生成；接種體積比為2:1時，釀酒酵母生成的乙醇與代謝物限制了球擬酵母的產酯能力，因此乙酸酯生成量較低。在Fan等[22]的研究中證明了S.cerevisiae和W.anomalus接種菌數比為1∶2時生成的乙酸乙酯是最高的，與本研究結果相似。釀酒酵母AY15與球擬酵母WY2混合發酵時同樣未檢測到乙酸異戊酯，這是由于釀酒酵母AY15生成乙酸異戊酯的能力較弱，球擬酵母的加入不能顯著提高乙酸異戊酯的生成能力。

2.2.3 不同接種體積比對高級醇生成量的影響

釀酒酵母AY15和MY15分別與菌株WY2以不同接種體積比（1∶1、1∶2、2∶1）進行混合發酵對高級醇的影響如圖3所示。

圖3 不同接種體積比對高級醇生成量的影響Fig.3 The impact of different inoculation proportion on higher alcohol production

由圖3可知，釀酒酵母菌株AY15與球擬酵母WY2以不同接種體積比進行混合發酵時，異丁醇和異戊醇的生成量與釀酒酵母AY15相比均被提高。但是高產酯釀酒酵母MY15與球擬酵母混合發酵時，異丁醇和異戊醇生成量沒有發生變化。這可能是因為MY15菌株具有較高的酯合成酶活性，促使異丁醇和異戊醇轉化為對應的乙酸酯，消耗了部分高級醇，因此混合發酵中的高級醇生成量與MY15純種發酵時沒有顯著差別。有研究證明，白酒的高級醇含量過高不僅會影響白酒的風味，飲用后還會引起“上頭”現象，影響人的健康。利用高產酯釀酒酵母MY15進行的混合發酵將高級醇控制在了較低的范圍內，這有助于提升白酒的品質。

2.3 不同接種順序對風味物質含量的影響

2.3.1 發酵性能理化指標分析

釀酒酵母與球擬酵母以不同接種順序進行混菌發酵時，發酵性能如表3所示。

表3 不同接種順序對發酵特征的影響Table 3 The impact of fermentation performance by different sequential culture

從表3中可以看出，各試驗組的CO2總失重在25.5 g～26.2 g之間，酒精度均為9.5%vol，發酵周期均為5 d，與AY15和MY15純種發酵相比均沒有顯著差異。這說明以1 d的時間間隔進行順序接種時，釀酒酵母和球擬酵母的產酒精能力未受到明顯的影響，這有利于白酒的釀造。楊婕等[23]發現，將L.thermotolerans菌株與S.cerevisiae以順序接種進行發酵時，混合體系中的酒精度會低于S.cerevisiae純種發酵。在吳軒德等[10]的研究中，先接種 S.cerevisiae，發酵 24 h 后再接種A.pasteurianus時，酒精度也出現了明顯降低。這些結果與本研究結果有所不同，這可能是由于球擬酵母菌種的發酵性能不同于L.thermotolerans和A.pasteurianus，在混合發酵體系中雖然存在競爭關系，但依舊能保持較好的產酒精能力。

2.3.2 不同接種順序對乙酸酯生成量的影響

不同的接種順序對混合發酵體系中乙酸酯生成量的影響如圖4所示。

圖4 不同接種順序對乙酸酯生成量的影響Fig.4 Effect of different inoculation sequence on the production of acetate ester

由圖4可知，以“釀酒酵母—球擬酵母”的順序接種時，試驗組AW和MW的乙酸乙酯生成量分別為15.37 mg/L和310.36 mg/L，與AY15和MY15純種發酵相比分別提高了24.55%和12.78%。這說明先接種釀酒酵母再接種球擬酵母有利于乙酸乙酯的生成。以“球擬酵母—釀酒酵母”的順序接種時，試驗組WA的乙酸乙酯生成量明顯提高，是AY15單獨發酵的2.05倍，但試驗組WM的乙酸乙酯生成量（189.91 mg/L）卻低于MY15純種發酵。這意味著球擬酵母的優先接種使菌體數量快速增長，增強了與釀酒酵母的競爭關系，影響乙酸乙酯的生成。由于釀酒酵母菌株AY15的產酯能力遠低于球擬酵母，在順序接種發酵時，球擬酵母能夠發揮產酯能力，小幅度地提升發酵體系整體的乙酸乙酯生成量；但高產酯釀酒酵母菌株MY15的產酯能力強于球擬酵母，因此球擬酵母的先接種雖然影響了MY15菌株的生長，但MY15菌株依然保持了其高產酯的發酵特性。順序接種發酵結束后，試驗組WM的乙酸乙酯生成量較球擬酵母單獨發酵相比，提升1.62倍。

2.3.3 不同接種順序對高級醇生成量的影響

不同的接種順序對混合發酵體系中高級醇生成量的影響如圖5所示。

圖5 不同接種順序對高級醇生成量的影響Fig.5 Effect of different inoculation sequence on higher alcohol production

由圖5可知，各試驗組的正丙醇生成量和苯乙醇生成量與AY15、MY15和WY2純種發酵的生成量相似，正丙醇生成量在17.84 mg/L～25.06 mg/L之間，苯乙醇生成量在64.26 mg/L～79.44 mg/L之間，而異丁醇生成量在先接種球擬酵母的試驗中提升了一倍。試驗組AW和WA異戊醇生成量比釀酒酵母AY15純種發酵生成量低，高于球擬酵母WY2純種發酵，而試驗組MW和WM異戊醇生成量低于AY15和WAY2純種發酵。因此，混合發酵體系中的高級醇終生成量決定于先接種菌株的高級醇生成量，后接種球擬酵母的方法，對高級醇生成量沒有太大的影響，甚至可以少量降低高級醇生成量。

3 結論

以工業釀酒酵母菌株AY15、高產酯釀酒酵母菌株MY15、球擬酵母WY2為出發菌株，分別通過單菌發酵、不同接種體積比的混菌發酵和不同接種順序的混菌發酵，檢測其發酵過程中發酵性能、乙酸酯及高級醇生成量的變化。結果表明，不同接種體積比以及不同接種順序對酵母發酵性能和高級醇生成量沒有顯著影響。當高產酯釀酒酵母MY15和球擬酵母WY2接種體積比為1∶2時生成的乙酸乙酯含量最高，為351.65mg/L。近幾年，非釀酒酵母的研究成為釀酒領域的熱點，但是對球擬酵母研究比較少。因此，將高產酯釀酒酵母與球擬酵母進行單獨和混菌發酵,發現混菌發酵優于單獨接種釀酒酵母或球擬酵母，在保證酵母發酵性能不變的前提下,能有效地利用發酵液中的酸類物質和高級醇,合成更多的酯類化合物，明顯提高了發酵產品的風味特征，揭示了球擬酵母對高產酯釀酒酵母產酯能力的強化作用，為高產酯釀酒酵母在清香型白酒發酵中的應用提供理論依據。