高效液相色譜法測定紙質食品接觸材料中雙酚A和雙酚S的含量

楊永超，杜宇，于艷軍，韓偉，李寧濤，熊中強，何成，王利兵

（天津海關工業產品安全技術中心，天津 300308）

雙酚A（bisphenol A，BPA）是聚碳酸酯、環氧樹脂以及阻燃劑生產過程中經常用到的化學物質。近年來，由于BPA的廣泛生產以及在食品接觸材料（food contact materials，FCMs）和食品容器中的大量應用，引起了人們極大關注。試驗證明，食品接觸材料中的BPA會遷移到食物中，遷移速度與食物的溫度、加熱時間及其理化特性相關[1-3]。BPA具有雌激素的特性，由于其結構與人體內雌二醇相似，故又稱雌激素或內分泌干擾物[4]，接觸BPA會導致一些疾病的發生，如生殖和生育能力方面疾病、肥胖和2型糖尿病等[5-7]。

雙酚 S即 4，4-二羥基二苯砜（bisphenol S，BPS），是BPA的等價物質。作為BPA的代用品，BPS通常用于生產環氧樹脂、聚碳酸酯、酚醛樹脂等物質，同時也用于生產醫用高分子材料、彩色攝影材料，也可作為固色劑、皮革鞣劑、染料的中間體以及阻燃劑等被廣泛用于食品接觸材料中[8-10]。研究表明，BPS同樣具有生物毒性，是一種內分泌干擾素（環境荷爾蒙），過量攝入會導致人和動物的內分泌、代謝和神經系統異常，可對人和動物生殖系統造成嚴重損傷，還可致癌、致畸和致突變[11-12]。

人類接觸BPA的主要途徑是食用含有BPA的包裝材料包裝的食品，通過皮膚或呼吸方式接觸富含BPA的物質[4，13-14]。BPS有很強的皮膚滲透性和吸收率[12]，皮膚接觸后更容易進入人體。因此，各國紛紛立法對食品接觸材料中這2種物質遷移量進行了限制。根據歐盟第10/2011號法規[15]，BPA對食品的特定遷移限制（specific migration limit，SML）為 0.6 mg/kg，BPS為0.05 mg/kg。我國國家標準GB 4806.6—2016《食品安全國家標準食品接觸用塑料樹脂》[16]規定了雙酚S特定遷移限量為0.05 mg/kg，雙酚A特定遷移限量為0.6 mg/kg。但這些法規都是針對塑料材質，未對紙質食品接觸材料進行限制。

我國針對紙質食品接觸材料的標準GB 4806.8—2016《食品安全國家標準食品接觸用紙和紙板材料及制品》[17]中未對BPA和BPS的含量以及遷移量做出具體規定。然而，據報道在歐洲的紙質食品包裝材料中發現了BPA，在回收用于造紙的纖維樣品中也發現了BPS[18]，證明風險確實存在。

目前，對BPA和BPS的檢測，基質多集中在水[19-20]、熱敏紙[11]、紡織品[21]、食品[22-23]以及食品包裝材料[24-25]，但是對于紙質食品接觸材料中的BPA和BPS的檢測則鮮有報道。因此，開發同時檢測紙質食品接觸材料中BPA和BPS的方法具有重要意義。在此基礎上，本文以高效液相色譜-二極管陣列（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）為檢測儀器，建立了同時測定紙質食品接觸材料中BPA和BPS的方法，為后期市場的監管提供技術支持和保障。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Ultimate 3000SD高效液相色譜儀[配置二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）]：美國 Thermal公司；KQ-800KDE高功率數控超聲清洗器：中國昆山市超聲儀器有限公司。

雙酚A 標準物質[4，4′-二羥基二苯丙烷（bisphenol A，BPA）]（純度≥99.0%）、雙酚S標準物質[4，4′-二羥基二苯砜（bisphenol S，BPS）]（純度≥99.0%）：德國Dr.Ehrensorfer公司；甲醇（色譜純）：德國merk公司。

1.2 方法

1.2.1 HPLC條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-CN（C18）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速為0.8 mL/min。柱溫：室溫 25℃；檢測波長：BPA為280 nm，BPS為259 nm；進樣體積5.0 μL。流動相為甲醇/水（體積比 1∶1）等度洗脫。

1.2.2 標準儲備液配制

準確稱取BPA和BPS各50 mg（精確至0.1 mg）分別置于50 mL容量瓶中，以甲醇定容，配成質量濃度為1 000 mg/L的標準溶液；分別移取兩種標準溶液5.0 mL至50 mL容量瓶，定容，得濃度為100 mg/L的BPA和BPS的混合標準儲備液。

1.2.3 樣品處理

將紙質食品包裝材料裁剪成5 mm×5 mm的小片，混合均勻。精確稱取0.100 0 g樣品置于50 mL的錐形瓶中，加入10 mL甲醇，在50℃恒溫振蕩水浴中提取50 min后取出，氮吹濃縮至5 mL以下，待溶液冷卻至室溫（25℃）后定容至10 mL，經0.45 μm濾膜過濾，濾液備用。

樣品處理方法參照文獻[26]，并在此基礎上進行改進。因為塑料制品耗材中可能存在BPA和BPS，為避免干擾，樣品處理過程中均用玻璃制品。

1.2.4 陽性樣品制備

將陰性樣品糖炒栗子包裝袋裁剪成5 mm×5 mm的小片，混合均勻，精確稱取0.100 0 g于50 mL的錐形瓶中，加入定量的混合標準儲備液，之后加入適量甲醇，潤濕全部樣品，最后自然揮發至干得陽性樣品，用于添加回收試驗。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

在190 nm～700 nm范圍內，測定雙酚A（BPA）和雙酚S（BPS）標準溶液紫外-可見吸收光譜，結果表明，BPA的兩個吸收峰波長為228 nm和280 nm，BPS的最大吸收峰波長為259nm。根據相關文獻報道[11，22-23]及為了避免在200 nm左右的溶劑和雜質峰的干擾，方法選擇BPA的檢測波長為280 nm，BPS為259 nm。

2.2 色譜柱的選擇

試驗考察了Acclaim 120-C18、InertSustain C18和ZORBAX Eclipse XDB-CN（規格均為 250 mm×4.6 mm，5 μm）反相柱分離效果，結果見圖1。

圖1 不同色譜柱對分離效果的影響（280 nm）Fig.1 Effects of different chromatographic columns on separation efficiency（280 nm）

結果表明Acclaim 120-C18和InertSustain C18柱BPS 出峰較早，BPA 出峰過晚[圖 1（d）和圖 1（c）]。梯度洗脫可縮短洗脫時間，但容易造成基線不穩，同時消耗更多的有機相[圖 1（b）]。ZORBAX Eclipse XDB-CN柱則可通過調整流動相等度洗脫，10 min內可完成洗脫，且峰形尖銳對稱，因此，選擇ZORBAX Eclipse XDB-CN柱進行等度洗脫。

2.3 流動相、流速及進樣體積的選擇

試驗考察了乙腈/水、甲醇/水作流動相對BPA和BPS分離效果的影響，結果表明，使用乙腈/水時，BPS的峰出現拖尾現象；當使用甲醇/水時，BPA、BPS完全分離，峰形尖銳，對稱性好，因此，選擇甲醇/水作為流動相。

兩種物質在甲醇/水等度洗脫過程中，可實現完全分離。等度洗脫過程中，最終確定流動相比例為甲醇/水體積比1∶1，該條件下，BPA和BPS分離度好，BPS出峰時間大于5 min，可避免一些雜質峰的影響，且整體洗脫時間可控制在10 min之內。

流動相流速對分離效果的影響見圖2。

圖2 流動相和流速對分離效果的影響（280 nm）Fig.2 Influence of flow phase and velocity on separation effect（280 nm）

由圖 2（a）～圖 2（c）可知，流速為 0.5 mL/min 時，洗脫時間大于12 min，且峰形展寬；流速為1.0 mL/min時，BPS出峰時間小于5 min，可能會有基質中的雜質峰干擾。綜合考慮，試驗最終選定流速為0.8 mL/min。

進樣量為 10 μL 時[圖 2（d）]，峰形前沿，進樣量為5 μL 時[圖 2（b）]，色譜峰恢復正常，說明這種情況可能是由色譜柱過載造成的，因此，試驗最終選定進樣量為 5 μL。

2.4 提取劑的選擇

試驗考察了甲醇、正己烷、乙腈和水的提取效率，結果見圖3。

圖3 不同溶劑對于BPA和BPS的提取效率的影響Fig.3 The efficiencies of different solvents for BPA and BPS

結果表明，對于BPA和BPS的提取，甲醇的提取效率＞98%，其它溶劑的提取效率均＜80%，因此，方法最終選擇甲醇為提取劑。

2.5 提取溫度和時間的確定

甲醇作為萃取劑，研究最佳的提取溫度和提取時間對提取效率的影響，結果見圖4。

圖4 提取溫度和提取時間對提取效率的影響Fig.4 The effect of extraction time and temperature on extraction efficiencies

從圖4（a）中可以看出，隨著溫度的增加，BPA和BPS的提取效率增加，50℃時達到最高，60℃與50℃時基本持平，從能源節省和減少甲醇揮發方面考慮，方法選擇的提取溫度為50℃。

如圖4（b）所示，提取時間為30 min時，提取接近完全，40 min～60 min變化不明顯，考慮到分析物盡可能提取完全和節省資源，方法最終選擇提取時間為40 min。

2.6 線性范圍和檢測限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）

精密量取1.2.2混合標準儲備液，以甲醇稀釋，得到 BPA 和 BPS 濃度為 1、5、10、25、50 mg/L 的系列混合標準溶液。上機測試，記錄BPA和BPS的峰面積，每個濃度點測試3次，取平均值。以濃度（mg/L）為橫坐標x，峰面積為縱坐標y，進行線性回歸。得到的回歸方程如表1所示，結果顯示，在1 mg/L～50 mg/L范圍內，BPA和BPS線性良好，相關系數均≥0.999 8。

表1 BPS和BPS的線性回歸方程、相關系數和檢測限、定量限Table 1 Regression equations，correlation coefficients，the limit of detection and quantification（LOD and LOQ）for BPA and BPS

采用逐級稀釋標準溶液方法進樣，信噪比（S/N）為3時的樣品濃度即為檢測限濃度（LOD）；S/N為10的樣品的濃度即為定量限濃度（LOQ）。如表1所示，BPA、BPS的 LOD和 LOQ分別為 0.10、0.02 mg/L和0.50、0.10 mg/L。

2.7 回收率和精密度試驗

按1.2.4方法制備低、中、高3個濃度水平陽性樣品，測試添加回收率，每個濃度點平行6份，結果見表2。參考標準GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》[27]對該方法進行評價，試驗三水平添加回收率在85.2%～103.0%之間，表明加標回收試驗結果良好。相應測定結果的相對標準偏差在1.26%～4.90%之間，證明該方法準確度和精密度良好。

表2 BPA和BPS低、中、高3濃度水平添加回收試驗（n=6）Table 2 Recovery results of BPA and BPS at 3 levels with low，medium and high concentrations（n=6）

2.8 樣品檢測

取市場上30個紙質食品接觸材料樣品，按1.2.3所述方法制備樣品上機測試，測試結果顯示，2個樣品檢出BPA，編號1#和2#，結果見圖5。

圖5 市場實際樣品檢測圖譜（280 nm）Fig.5 The spectra of actual samples in market（280 nm）

由圖5可知，1#樣品檢出少量BPA，同時樣品5 min以前出現很多雜質峰。該方法BPA的出峰時間大于5 min，可有效避免大部分雜質干擾。2#樣品除了檢出較高濃度的BPA[圖5（b）峰1]，在12 min左右出現峰2，查看其后臺紫外吸收圖譜，基本與BPA紫外圖譜一致，推測為BPA的衍生物或同系物，后續工作將對該物質展開研究。

3 結論

本文建立了紙質食品包裝材料中BPA和BPS含量測定的高效液相色譜法。方法中BPA和BPS的最低檢出限可達0.10 mg/L和0.02 mg/L，加標回收率在85.2%～103.0%，相對標準偏差小于5%。該方法具有前處理簡單、穩定性好、回收率高等優點，檢測結果準確可靠，可應用于市場上紙質食品接觸材料制品中BPA和BPS的測定，為食品包裝材料的安全監管和風險評估提供技術支持和保障。