富含γ-氨基丁酸的紅小米黃酒釀造工藝參數優化

李杰，許彬，羅建成，李慧星，于海彥，張紫璇，戴洪暢

（1.南陽理工學院張仲景國醫國藥學院，河南 南陽 473004；2.南陽理工學院生物與化學工程學院，河南 南陽 473004）

紅小米，為南陽盆地特產，因谷殼呈紅色，本地俗稱紅谷，學名為“粟”，也稱作粱、粟米，是禾本科一年生草本植物“粟”加工去皮后的成品。紅小米與糯米、黍米等農作物相比，淀粉含量較低，蛋白質、脂肪和維生素含量較高，且富含人體必需的8種氨基酸，比例協調，具有較高的營養價值。

黃酒是世界上最古老的酒類之一，在我國已有3 000余年的歷史，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒[1-2]。傳統黃酒是以糯米、粟米等為原料，采用酒曲糖化、發酵而成，色澤淺黃或紅褐，質地醇厚，品味香甜甘冽，濃郁芳香，集甜、酸、苦、辛、鮮、澀六味一體。黃酒富含8種必需氨基酸、活性多肽、功能性低聚糖、有機酸、多種維生素及微量元素等易被人體吸收的營養成分[3-8]，被譽為“液體蛋糕”。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質氨基酸，在人體內具有調節心率、降低血壓、預防動脈硬化、調節內分泌、預防糖尿病、健肝利腎、防止皮膚老化等特殊生理功能[9-11]。GABA作為一種具有特殊生理活性的功能性因子越來越引起人們的關注，研究表明，黃酒釀造時所用麥曲、紅曲、酒藥中的霉菌、酵母、細菌等微生物，在代謝過程中可利用谷氨酸（Glu）作為前體物質合成GABA[12]。紅小米為南陽盆地特色農作物，與GABA合成代謝所需的前體物質谷氨酸含量達2.92%[13-14]。本研究以紅小米為主要原料，對富含GABA的紅小米黃酒釀造工藝參數進行優化，可為企業生產實踐提供有價值的理論參考。富含GABA的紅小米黃酒的產業化生產，將極大提高南陽黃酒的知名度，提升南陽“世界美酒特色產區”的品牌影響力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅小米：南陽市鎮平縣；紹酒風味T3釀酒曲（根霉菌、α-淀粉酶（20000U/g）、葡萄糖淀粉酶（100000U/g）、釀酒酵母）：安琪酵母股份有限公司；麥曲：山東梁山徐曙生物工程有限公司。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）對照品：中國食品藥品檢定研究院；重蒸苯酚：北京索萊寶科技有限公司；四硼酸鈉、氫氧化鉀：國藥集團化學試劑有限公司；次氯酸鈉、三氯化鋁、硼酸、無水乙醇：天津科密歐化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BS110S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；HHS-6電熱恒溫水浴鍋：上海躍進醫療器械廠；XK05-IMS20制冰機：北京中西遠大科技有限公司；752N紫外-可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；XH-A旋渦混合器：無錫杰瑞安儀器設備有限公司；DNP-9082電熱恒溫培養箱：上海精宏試驗設備有限公司；TGL-16GR高速臺式冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紅小米黃酒釀造工藝流程

采用攤飯法釀造紅小米黃酒，具體工藝流程如下。

浸米→蒸煮→攤涼→拌曲（釀酒曲、麥曲）→裝罐→前發酵及開耙→后發酵→過濾→煎酒（滅菌）→裝壇→陳釀

1.3.2 GABA標準曲線的繪制

精密稱取GABA 20.0 mg，蒸餾水溶解，定容至100 mL，搖勻，得濃度為0.2 mg/mL的GABA標準溶液。分別吸取稀釋至 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mg/mL的GABA標準溶液1.0 mL，于10 mL具塞試管中，分別加入0.2mL濃度為0.2mol/L的H3BO3緩沖液（pH 9.0）、6%的重蒸苯酚1.0 mL、7%的次氯酸鈉溶液0.4 mL，置于漩渦振蕩器混勻，沸水浴條件下反應10 min，迅速在冰浴條件下冷卻15 min，出現藍綠色后加入60%的乙醇2.0 mL；另吸取1.0 mL蒸餾水代替GABA標準溶液置于10 mL具塞試管，經上述反應及顯色等處理后作為空白對照；分別于630 nm波長處測OD值，以測得的OD值為縱坐標，GABA濃度為橫坐標，繪制標準曲線[15-16]。

1.3.3 單因素試驗

分別稱取經預處理的紅小米100 g，置于潔凈的500 mL燒杯內，加自來水浸泡，水面超過米層3 cm左右，燒杯口部用2層無菌紗布覆蓋，室溫20℃下浸泡，早晚各換水1次。24 h后瀝干水分，置不銹鋼鍋內蒸2 h，攤涼冷卻至35℃；分別選擇麥曲用量（5.5%、7.0%、8.5%、10.0%、11.5%、13.0%）、釀酒曲用量（0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%）、前發酵溫度（19、22、25、28、31、34 ℃）、前發酵時間（3、5、7、9、11、13 d）、后發酵溫度（9、12、15、18、21 ℃）、后發酵時間（25、35、45、55、65、75 d）6 個因素作為考察因素，選擇料液比為1∶1.3（g/mL）進行發酵，釀造紅小米黃酒。單因素試驗時，每次試驗固定其余因素，考察單一因素對GABA含量的影響。

1.3.4 均勻設計試驗

在單因素試驗基礎上，選擇麥曲用量（X1）、釀酒曲用量（X2）、前發酵溫度（X3）、前發酵時間（X4）、后發酵溫度（X5）、后發酵時間（X6）6 個因素，進行均勻設計試驗[17-19]，選擇料液比為 1∶1.3（g/mL）進行發酵，考察不同釀造工藝對紅小米黃酒中GABA含量的影響。試驗的因素水平如表1所示。

表1 均勻設計試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of uniform design experiment

1.3.5 建立具有預測功能的多層前饋（backpropagation，BP）神經網絡

以均勻設計試驗結果數據作為BP神經網絡的訓練樣本，考慮到均勻設計試驗中因素數為6，輸入層神經元個數選擇6；試驗指標數（GABA含量）為1，輸出層神經元個數選擇1；中間層神經元個數根據經驗選擇6；故BP神經網絡的拓撲結構為6-6-1，選擇BP神經網絡訓練收斂精度為10-3，利用MATLAB軟件，建立BP神經網絡[20-21]，并隨機選擇3組實測值與BP神經網絡的預測值進行對比。

1.3.6 確定BP神經網絡的最優預測值

以BP神經網絡的預測輸出值作為遺傳算法求解的目標值，以均勻設計試驗結果作為遺傳算法的初始種群，種群規模為12，根據經驗，選擇交叉概率0.05，變異概率0.01，采用遺傳算法尋優確定BP神經網絡的最優預測值[22-23]。

1.3.7 紅小米黃酒中GABA含量測定

準確量取30.0 mL紅小米黃酒樣液，作為待測酒樣，向其中加入2.0 mol/L的A1C13溶液150 μL，充分混勻振蕩10 min，12 000 r/min離心5 min，吸取15.0 mL上清酒液，加入l.0 mol/L的KOH溶液9.0 mL，充分混勻振蕩5 min，12 000 r/min離心5 min。使用移液槍吸取適量經離心處理的上清酒液，根據GABA標準曲線的繪制方法，測定酒樣的OD值，計算GABA含量[24-25]。

1.4 數據處理

單因素試驗數據處理采用Origin10.5.1軟件進行圖形繪制，并對結果進行綜合分析；均勻設計試驗數據處理采用MATLAB軟件2019中的神經網絡工具箱、動態仿真和優化控制工具箱，進行BP神經網絡的模型建立、試驗數據的仿真模擬及最優參數的預測。

2 結果與討論

2.1 GABA標準曲線繪制結果

根據GABA標準曲線制作方法，建立γ-氨基丁酸濃度和吸光度值之間的關系曲線，結果見圖1。

圖1 GABA標準曲線Fig.1 The standard curve of GABA

以GABA濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=4.7748x-0.0032，R2=0.9987。

2.2 單因素試驗結果及分析

2.2.1 麥曲用量對紅小米黃酒GABA含量影響

麥曲用量對紅小米黃酒中GABA含量的影響見圖2。

圖2 麥曲用量對GABA含量影響Fig.2 Effect of wheat starter dosage on GABA content

由圖2可知，麥曲用量為5.5%～10.0%時，隨著麥曲用量增大，霉菌菌群所產糖化酶量不斷增加，并與釀酒曲中的α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶及根霉所產糖化酶共同作用，將紅小米中淀粉降解，為釀造體系中的微生物菌群提供更多碳源，微生物在增殖及代謝過程中，通過GABA合成代謝途徑關鍵酶谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）產生大量 GABA，黃酒醪液中GABA含量不斷增加；麥曲用量為10.0%時，紅小米所含淀粉水解達到飽和，微生物通過GAD合成GABA與通過γ-氨基丁酸轉氨酶（γ-aminobutyric acid transaminase，GABA-T）及琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）對GABA進行轉化的速率處于動態平衡，繼續增大麥曲用量，黃酒醪液中GABA含量增加也不明顯。

2.2.2 釀酒曲用量對紅小米黃酒GABA含量影響

釀酒曲用量對紅小米黃酒中GABA含量的影響見圖3。

圖3 釀酒曲用量對GABA含量影響Fig.3 Effect of brewing raw starter dosage on GABA content

由圖3可知，釀酒曲用量為0.30%～0.40%時，隨釀酒曲用量增大，釀酒曲中根霉菌所產糖化酶量逐漸增加，協同釀酒曲中的α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶及麥曲中霉菌所產糖化酶，將紅小米所含淀粉降解，微生物可獲得足夠碳源，迅速增殖。通過菌體代謝，在GAD作用下產生大量GABA，黃酒醪液中GABA含量不斷增加；釀酒曲用量增加至0.40%時，紅小米所含淀粉水解達到飽和狀態，微生物的生長速率處于穩定狀態，GABA通過GAD的合成速率與通過GABA-T及SDH的轉化速率處于平衡狀態，繼續增大釀酒曲用量，對黃酒醪液中GABA含量的影響也不大。

2.2.3 前發酵溫度對紅小米黃酒GABA含量影響

前發酵溫度對紅小米黃酒中GABA含量的影響見圖4。

圖4 前發酵溫度對GABA含量影響Fig.4 Effect of pre-fermentation temperature on GABA content

由圖4可知，前發酵溫度為19℃～28℃時，黃酒醪液中GABA含量隨前發酵溫度升高逐漸增加。可能是前發酵溫度較低時，麥曲及釀酒曲中微生物增殖緩慢，GAD活性較低，產生的GABA量較少；隨前發酵溫度升高，菌體代謝活動加快，GAD活性增強，產生GABA量逐漸增加。前發酵溫度高于28℃時，麥曲及釀酒曲中微生物快速增殖，釋放大量生物熱，醪液升溫迅速，菌體發生早衰，不利于GABA積累，黃酒醪液中GABA含量隨前發酵溫度升高而下降。

2.2.4 前發酵時間對紅小米黃酒GABA含量影響

前發酵時間對紅小米黃酒中GABA含量的影響見圖5。

圖5 前發酵時間對GABA含量影響Fig.5 Effect of pre-fermentation time on GABA content

由圖5可知，前發酵時間為3 d～9 d時，隨前發酵時間延長黃酒醪液中GABA含量逐漸增大。可能是前發酵時間較短時，紅小米所含淀粉未被充分降解利用，碳源供給有限，微生物增殖量少，在GAD作用下產生的GABA量也較少；隨前發酵時間延長，紅小米所含淀粉被充分水解，碳源供給充足，微生物快速增殖，在GAD作用下產生的GABA量逐漸增加。前發酵時間大于9 d時，由于微生物通過緩慢的呼吸代謝，使GABA在GABA-T及SDH的作用下繼續轉化生成琥珀酸，進入三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle），黃酒醪液中GABA含量隨前發酵時間延長有所下降。

2.2.5 后發酵溫度對紅小米黃酒GABA含量影響

后發酵溫度對紅小米黃酒中GABA含量的影響見圖6。

圖6 后發酵溫度對GABA含量影響Fig.6 Effect of post-fermentation temperature on GABA content

由圖6可知，后發酵溫度為9℃～15℃時，黃酒醪液中GABA含量隨后發酵溫度升高逐漸增加。可能是后發酵溫度較低時，釀造體系中微生物代謝緩慢，GAD活性較低，生成的GABA量較少；隨后發酵溫度升高，菌體代謝速率有一定程度增大，GAD活性增強，產生GABA量有所增加。后發酵溫度高于15℃，后發酵前期發酵速度過快，酒精迅速積累，抑制菌體內參與GABA合成代謝的關鍵酶GAD的活性，同時釀造體系中細菌的代謝活動受到抑制，醪液總酸含量較少，進一步降低GAD活性，黃酒醪液中GABA含量隨后發酵溫度升高快速下降[26]。

2.2.6 后發酵時間對紅小米黃酒GABA含量影響

后發酵時間對紅小米黃酒中GABA含量的影響見圖7。

圖7 后發酵時間對GABA含量影響Fig.7 Effect of post-fermentation time on GABA content

由圖7可知，后發酵時間為25 d～65 d，黃酒醪液中GABA含量隨后發酵時間延長逐漸增加。可能是由于從后發酵前期到中期，罐內逐漸處于厭氧環境，抑制GABA分解代謝途徑中的GABA-T及SDH活性，同時醪液中總酸含量上升，pH值下降，GAD活性增強，不斷積累GABA；后發酵后期，釀造體系中微生物菌體發生自溶，GABA被逐步釋放，GABA含量隨后發酵時間延長逐漸增加。后發酵時間大于65 d時，GABA已被充分釋放，隨后發酵時間繼續延長，黃酒醪液中GABA含量變化不大。

2.3 均勻設計試驗結果

根據均勻設計試驗因素水平表的安排進行試驗，具體結果見表2。

表2 均勻設計試驗結果Table 2 The results of uniform design experiment

以均勻設計試驗的結果數據作為BP神經網絡的訓練樣本，利用MATLAB軟件，建立BP神經網絡，神經網絡訓練過程的均方誤差變化曲線如圖8所示。

圖8 BP神經網絡訓練過程均方誤差變化曲線Fig.8 The mean square error variation curve of BP neural network training process

由圖8可知，經持續學習訓練，BP神經網絡訓練均方誤差逐漸減小，當訓練8 489次時，BP神經網絡均方誤差為0.000 499 1，小于設定值0.001，神經網絡收斂，訓練結束。

隨機選擇均勻設計試驗結果中的3組數據，輸入訓練后的BP神經網絡，將網絡預測輸出值與實測值進行對比，如圖9所示。

圖9 3組隨機選擇實測值與BP神經網絡預測值對比Fig.9 The three groups randomly selected and measured values compared with the predicted values of BP neural network

由圖9可知，預測值和實測值比較接近，故可利用訓練后的BP神經網絡預測紅小米黃酒在不同釀造工藝參數情況下，黃酒醪液中GABA含量。

遺傳算法對訓練后的BP神經網絡最優預測值的求解軌跡，如圖10所示。

圖10 遺傳算法尋優求解軌跡Fig.10 The optimizing and solving trajectory of genetic algorithm

由圖10可知，當遺傳、交叉、變異、復制進行200代，遺傳算法優化求解得出的最大適應度值（即GABA最高含量）為0.138 7 mg/mL，此時，與最大適應度值（GABA含量）相對應的紅小米黃酒釀造工藝參數為麥曲用量10.35%，釀酒曲用量0.42%，前發酵溫度24.31℃，前發酵時間6.42 d，后發酵溫度14.22℃，后發酵時間70.16 d。

為便于實踐操作，將上述釀造工藝參數進行適當修正如下：麥曲用量10.35%，釀酒曲用量0.42%，前發酵溫度24℃，前發酵時間6 d，后發酵溫度14℃，后發酵時間70 d。根據修正后的釀造工藝參數釀造3罐紅小米黃酒，測得黃酒醪液中GABA含量平均值為0.139 8 mg/mL。結果比BP神經網絡預測最優值稍大，說明修正后的釀造工藝參數具有較強的工程實踐意義，可按此工藝參數進行富含GABA紅小米黃酒的釀造。

3 結論

在單因素試驗基礎上，進行均勻設計試驗，利用MATLAB軟件，以均勻設計試驗數據為訓練樣本，采用BP神經網絡建立了紅小米黃酒釀造工藝參數與GABA含量之間關系的數學模型，利用模型可對在不同釀造工藝參數組合條件下紅小米黃酒中GABA含量進行高精度預測。

采用遺傳算法對訓練后的BP神經網絡最優預測值（GABA含量最高）及相應的紅小米黃酒釀造工藝參數進行優化求解，并結合工程實際適當修正，確定富含GABA的紅小米黃酒較優釀造工藝參數為：麥曲用量10.35%，釀酒曲用量0.42%，前發酵溫度24℃，前發酵時間6 d，后發酵溫度14℃，后發酵時間70 d。在此條件下釀造的紅小米黃酒，GABA含量可達0.1398mg/mL。

文中主要對富含GABA的紅小米黃酒釀造工藝參數進行了優化，但紅小米黃酒釀造過程中GABA含量的動態變化及GABA合成的代謝調控還有待于進一步研究。