基于響應面設計的狹果茶藨子果酒發酵工藝優化

吉正梅，葉英，2*，姜文，王樹林，曹效海，韓麗娟

（1.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016；2.青海省青藏高原農產品加工重點實驗室，青海 西寧 810016）

狹果茶藨子（Ribes stenocarpum Maxim.）又名長果醋栗，與黑果茶藨（黑加侖）同屬虎耳草科茶藨屬（Ribes L.）漿果植物[1]。據統計茶藨屬植物全世界有160多種，我國約50余種，青海、西藏、甘肅、陜西、云南、四川等地均有分布[2]，其中青海省有11種1個變種[3]。狹果茶藨子果實味酸、性溫，具有解毒功能，種子富含亞油酸，具有軟化血管、防治動脈硬化等功效[4]。其果實營養豐富，含有豐富的糖類、氨基酸等多種元素[5-7]，是制作果汁、果酒、果醬等的佳品。

我國茶藨子資源豐富[8]，種類較多，但尚未進行有效開發利用，研究進展緩慢，已有的文獻報道也是屈指可數。何可群等[6]研究了貴州亨利茶藨子中化學成分的提取與分離方法，并對茶藨子粗提物進行了抗菌活性研究；袁鳳蓮[7]對新疆茶藨子的茶產品加工工藝進行了報道；賈健輝等[9]對東北茶藨子復合飲料制備工藝進行了研究；李靜等[10]發現五裂茶藨子葉中黃酮類化合物可抑制炎癥因子；葉英等[11]對青藏高原狹果茶藨子粗提物進行了研究，發現其具有良好的抑菌活性及抗疲勞活性。狹果茶藨子發酵性能良好，在前期研究中發現，狹果茶藨子鮮果在一定條件下放置一段時間后可自行發酵產生獨特的酒香味，具有加工成優質果酒的潛力。

果酒是水果經發酵制成的低度飲料酒，主要成分除乙醇外，還富含還原糖、氨基酸、維生素及多酚類等營養物質[12]。果酒具有抗氧化[13]、激發肝功能的功效[14]，還有利于情緒的調節[15]，飲用適量果酒可促進機體血液循環和新陳代謝[16]。陳玲等[17]研究表明枸杞果酒中富含多種生物活性成分，具有清除自由基、抗腫瘤和調節免疫等功能；孫曉偉等[18]研究發現黑加侖果酒中富含氨基酸和礦質元素等，具有控制糖尿病、改善血液循環、改善老年人健忘癥等功能。

近幾年，隨著年輕人飲酒習慣的改變，對于酒的口感要求開始朝清新柔和的方向轉變，導致果酒需求量逐年上升。據調查顯示，2011年～2016年我國果酒銷售年增長率平均達23%[19]。如今，新型果酒產品研發具有廣闊的市場前景。本試驗以青海地區狹果茶藨子果實為原料，采用響應面法優化狹果茶藨子果酒發酵工藝，制備得到新型狹果茶藨子果酒，以期豐富現有果酒品種，并為狹果茶藨子在果酒上的應用提供參考，進而促進青藏高原茶藨子資源的開發利用。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

狹果茶藨子：采自青海省互助縣；果膠酶（酶活力≥60 000 U/mL）、香檳酵母、降酸酵母、陳釀型干紅酵母、焦亞硫酸鉀、發酵助劑：煙臺帝伯仕自釀機有限公司；丹寶利釀酒高活性干酵母：丹寶利酵母股份有限公司；安琪果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；單寧：齊齊哈爾臺龍食品有限公司；白砂糖：山東雅匯糖業有限公司。

1.2 儀器與設備

YM-75高壓蒸汽滅菌鍋：海三申醫療器械有限公司；JA1003電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；DHG 9070A電子鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；WDP-450電熱恒溫培養箱：上海安亭科學儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計：蘇州島津儀器有限公司；PAL-109酒精計：河北省武強縣威爾儀表廠。

1.3 狹果茶藨子果酒制備工藝

1.3.1 工藝流程

原料處理→打漿→果膠酶酶解→調酸→調糖→添加SO2、單寧、發酵助劑→接種酵母→發酵→過濾→澄清→滅菌裝瓶

1.3.2 操作要點

原料選取及破碎：選取果粒大且飽滿、無蟲眼的狹果茶藨子鮮果，去除果梗后，打漿備用。

果膠酶處理：果膠酶添加量為0.5 g/L，在45℃水浴鍋中酶解4 h，以提高果漿的出汁率。

添加SO2、單寧、發酵助劑：焦亞硫酸鉀、單寧和發酵助劑的添加量分別為0.1 g/L、0.1%和0.5%，并與果漿充分混勻。

酵母活化：釀酒酵母用5%的糖水活化20 min，確保酵母的活性，再加入到果漿中攪勻。

1.3.3 試驗設計

首先以不同種類酵母（香檳酵母、降酸酵母、陳釀型干紅酵母、丹寶利釀酒高活性干酵母、安琪果酒專用酵母）、主發酵時間（5、6、7、8、9、10、11 d）、初始糖含量（10%、15%、20%、25%、30%、35%）、初始 pH 值（2、3、4、5、6、7）、酵母添加量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%）為單因素，在發酵溫度為28℃的條件下按照1.3.1的工藝流程發酵。再以單因素試驗為基礎，選擇初始糖含量（A）、酵母添加量（B）、主發酵時間（C）為評價因素設計三因素三水平響應面試驗，因素與水平設計見表1，以果酒酒精度和感官評分為指標，確定果酒發酵的最佳工藝。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Response surface factor level

1.3.4 理化指標檢測及感官評價方法

總糖：參考王文平等[20]的方法，采用苯酚-硫酸法測定狹果茶藨子果酒中的總糖含量。以葡萄糖作為標品繪制標準曲線方程Y=0.654 6X+0.022 7，R2=0.997；總酸：參考蔡成翔[21]的方法，利用酸堿滴定原理測定；總揮發酸：參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]檢測狹果茶藨子果酒中總揮發酸含量；總有機酸：參考曾竟藍等[23]的方法，以沒食子酸作為標品繪制標準曲線方程Y=0.211 8X+0.123 2，R2=0.998，計算總有機酸含量；總酚：參考吳彭等[24]的方法，采用福林酚法測定狹果茶藨子果酒中的總酚含量；還原糖：參考李雪梅等[25]的方法，采用直接滴定法測定狹果茶藨子果酒中的還原糖含量；總黃酮：參考張自萍等[26]的方法，以蘆丁作為標品繪制標準曲線方程Y=22.6X+0.036 8，R2=0.997，計算總黃酮含量；微生物檢測：菌落總數的檢測采用平板計數法[27]，大腸菌群的檢測采用乳糖發酵法，致病菌不得檢出。

感官評價方法：主發酵結束后，選取15名食品專業人員從狹果茶藨子果酒的色澤、澄清度、香氣、滋味4個方面進行感官評分。評分標準見表2。

表2 感官評價Table 2 Sensory evaluation

2 結果與分析

2.1 最佳活性干酵母篩選

不同酵母菌菌種對狹果茶藨子果酒酒精度和感官評分的影響見表3。

表3 不同酵母菌菌種對狹果茶藨子果酒酒精度、感官評分的影響Table 3 Effect of different yeast strains on the alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine

由表3可知，降酸酵母主發酵結束時酒精度最高，為13.2%vol，感官評分也最高，為87分，最終發酵酒體呈橙黃色、澄清透明、協調適口，具有獨特狹果茶藨子果香，其它酵母發酵得到的果酒整體口感偏酸。這說明在降酸酵母作用下，狹果茶藨子果實中豐富的有機酸被利用轉化為其他物質，可以有效改善狹果茶藨子果實原有的酸澀口感，且降酸酵母相比其他酵母可有效縮短狹果茶藨子果酒主發酵時間。

不同酵母菌菌種發酵過程中總糖含量變化見圖1。

圖1 不同酵母菌對狹果茶藨子果酒總糖變化的影響Fig.1 The effect of different yeasts on the fermentation of R.stenocarpum fruit wine

由圖1可知，丹寶利酵母發酵較慢，且從第2天起總糖含量下降較快；香檳酵母和陳釀型干紅酵母發酵較旺盛，第10天時主發酵結束；安琪果酒專用酵母第7天時發酵較劇烈，總糖含量迅速下降，第11天主發酵結束；使用降酸酵母進行發酵，從第2天開始，總糖含量呈穩定下降趨勢，由最初249.65 g/L下降至4.36 g/L，主發酵第8天時終止，發酵過程較穩定。降酸酵母在果酒發酵過程中發酵平穩，發酵時間適中，酒體風味和口感最好，綜合酒精度和感官評分的結果，選擇降酸酵母作為狹果茶藨子果酒制備的主要酵母。

2.2 主發酵時間單因素試驗結果

主發酵時間對狹果茶藨子果酒酒精度及感官評分的影響見圖2。

圖2 主發酵時間對狹果茶藨子果酒酒精度及感官評分的影響Fig.2 The effect of main fermentation time on the alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine

由圖2可知，狹果茶藨子果酒酒體的酒精度和感官評分隨著主發酵時間延長呈現先增大再下降的趨勢。發酵至第8天時，果酒的酒精度和感官評分均達最高，酒精度為13.5%vol，感官評分為89分。結合2.1結果可知，主發酵時間較短時發酵不充分，酒體中總糖含量高，酒精度和香氣成分積累不夠，進而會影響酒體的感官品質；當主發酵時間過長時由于營養物質的過度消耗不利于酵母菌生長繁殖，此時酵母菌會大量自溶或者代謝產生不良產物。因此，選擇8 d為果酒發酵的最佳主發酵時間。

2.3 初始糖含量單因素試驗結果

初始糖含量對狹果茶藨子果酒酒精度及感官評分的影響見圖3。

圖3 初始糖含量對狹果狹果茶藨子果酒酒精度及感官評分的影響Fig.3 The effect of initial sugar content on the alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine

由圖3可知，初始糖含量為10%、15%時，果酒的口感有酸澀味，且酒精度和感官評分偏低；初始糖含量為30%時果酒酒精度和感官評分均達到最大值，酒精度達14.5%vol，感官評分為88分。初始糖含量為35%時，果酒的口感偏甜，掩蓋了狹果茶藨子果實本身獨有的風味。因此，選擇初始糖含量30%作為茶藨子果酒發酵的最佳初始糖含量。

2.4 初始pH值單因素試驗結果

初始pH值對狹果茶藨子果酒酒精度及感官評分的影響見圖4。

圖4 初始pH值對狹果茶藨子果酒酒精度及感官評分的影響Fig.4 The effect of initial pH on the alcohol content and sensory scores of R.stenocarpum fruit wine

由圖4可知，當初始pH值為2、3、4時，果酒的口感較酸，當初始pH值調整至5時，果酒的口感風味較好，酒精度和感官評分均達到最大值，酒精度達14.0%vol，感官評分為87分，pH值進一步增加，果酒略帶鈉鹽味，感官評分較低。因此，初始pH 5適宜茶藨子果酒發酵。

2.5 酵母添加量單因素試驗結果

酵母添加量對狹果茶藨子果酒酒精度及感官評分的影響見圖5。

圖5 酵母添加量對狹果茶藨子果酒酒精度及感官評分的影響Fig.5 The effect of yeast addition on alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine

由圖5可知，酵母添加量為0.02%和0.03%時，果酒酒精度和感官評分都較低，可見此時發酵并不完全；酵母添加量為0.05%時酒精度和感官評分均達最大值，酒精度為14.2%vol，感官評分達88分，此時果酒的香氣成分和風味物質形成較完全；繼續增加酵母添加量，酒精度和感官評分均下降，這可能是酵母對發酵底物消耗速度過快造成的。因此，選擇酵母添加量0.05%作為果酒發酵的最佳條件。

2.6 響應面試驗結果

2.6.1 響應面試驗結果及方差分析

狹果茶藨子果酒發酵的響應面試驗結果見表4，方差分析見表5。

表4 響應面試驗結果與分析Table 4 Response surface test results and analysis

表5 以感官評分為指標的響應面試驗方差分析結果Table 5 The variance analysis result of response surface test with sensory score as index

采用多元回歸擬合上述試驗結果，得到以感官評分為目標函數Y=-1 016.8+20.29A-0.12B+121.6C-70AB+0.2AC-300BC-0.284A2-71B2-7.1C2。由表5可知，該試驗模型 P＜0.01（極顯著），失擬項 P=0.995 0（不顯著），此外，該模型相關系數R2=0.974 7，說明該試驗模型設計合理，能充分擬合試驗數據，可用于狹果茶藨子果酒制備的工藝分析和預測。在所設計的試驗范圍內各因素對狹果茶藨子感官評分的影響依次為A>B>C，即初始糖含量＞酵母添加量＞主發酵時間。

2.6.2 交互作用分析

各個因素交互作用關系見圖6。

圖6 兩因素交互作用的響應曲面圖Fig.6 Response surface plot of the interaction of each two factors

由圖6可知，A與B、B與C交互作用的三維圖較陡，曲面變化較為明顯，等高線圖呈橢圓形，說明A、B交互作用和B、C交互作用對果酒的感官評分影響較大，初始糖含量的曲線變化幅度較大，尤其說明該因素對果酒感官評分的影響較大；A與C交互作用三維圖坡面較陡，但變化不顯著，故主發酵時間與初始糖含量的交互作用對茶藨子果酒的感官評分影響并不明顯。

2.6.3 驗證試驗

通過響應面設計試驗結果分析，狹果茶藨子果酒最佳發酵工藝條件為：初始糖含量30.13%，酵母添加量0.047%，主發酵時間8 d，在此條件下，得到果酒酒精度為14.10%vol，感官評分為95分。考慮到實際可操作性和便利性，將主發酵條件修正為初始糖含量30%，酵母添加量為0.05%，主發酵時間為8 d，在此條件下進行驗證試驗。經過3組平行試驗，得到最終狹果茶藨子果酒酒精度為14.0%vol，感官評分為94分，與模型預測值接近，驗證了試驗結果的可靠性。

2.7 狹果茶藨子果酒理化指標檢測結果

狹果茶藨子果酒理化指標檢測結果見表6。

表6 狹果茶藨子果酒理化指標測定結果Table 6 Determination of physical and chemical indexes of Ribes stenocarpum wine

由表6可知，發酵得到的狹果茶藨子果酒中營養物質豐富，其中總酚含量達1.36 g/L，總黃酮含量達2.15 g/L，這可能是其風味的主要物質來源，具體風味成分種類有待進一步分離鑒別。狹果茶藨子果酒細菌總數為16 CFU/mL（≤100 CFU/mL），未檢測出大腸桿菌和致病菌，符合相關衛生標準。

3 結論

通過響應面分析法得到狹果茶藨子果酒的最佳發酵工藝條件：初始糖含量30%，初始pH5，酵母添加量0.05%，主發酵時間8 d。在此工藝條件下發酵得到的果酒色澤鮮艷，呈橙黃色，果香濃郁，滋味醇厚，酒體協調，酒精度達14.0%vol，感官評分94分。測得果酒中總酸含量30.35 g/L，揮發酸含量為0.32 g/L，總有機酸含量為1.16 g/L，總糖含量4.36 g/L，還原糖含量4.27 g/L，總酚含量1.36 g/L，總黃酮含量2.15 g/L，細菌總數和大腸桿菌總數均符合國家標準。