天然檸檬汁催化人參須根粉制備20（S,R）-Rg3和Rg5工藝研究

葉安琪，趙迅，張躍偉*，李玲，成樂琴*

（1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022；2.吉林省彩森仁生物科技有限責任公司，吉林 吉林 132022）

五加科人參屬草本植物人參，藥用部位為其干燥根，在亞洲作為一種傳統中藥已有數千年的歷史[1-2]。目前，人參在中草藥市場上仍然占有突出的地位，被認為是世界上使用最廣泛的藥食同源食品之一[3-5]。2012年人參被列為新資源食品，自此人參行業在中國進入了快速發展的時期[6]。人參內含有多種人體所必需的營養成分和生物活性物質，如人參皂苷、多糖、揮發油等，具有較高的價值[7-8]。人參皂苷是人參中功效作用較為豐富的一種主要活性成分，其分離方法及生理活性研究一直是人們廣泛討論的話題。人參皂苷主要由 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 組成，占人參總皂苷含量的90%[9]。然而，研究表明，通過對原人參皂苷進行糖基修飾而得到的稀有人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5具有更大的功效潛力[10-11]，稀有人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5在諸多藥理活性試驗中表現出較強的抗癌、抗炎、抗糖尿病等功效[12-16]。

目前，將人參中的人參皂苷轉化成稀有人參皂苷主要采用兩種方法，即先提取分離人參皂苷，再進行結構修飾[17]；或先進行結構修飾，再提取分離[18]，但這些方法存在制備時間長、專一性差、得率低、溶劑消耗大、耗能高等缺點[19-22]。本文利用多功能改進型索氏提取器，以人參須根粉為原料，研究檸檬汁催化制備稀有人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的工藝條件，探索綠色、高效、簡便的稀有皂苷制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

檸檬、人參須根粉：市售；甲醇（色譜純）、無水乙醇（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國Tedia公司；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司；人參皂苷標準品：成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

多功能改進型索氏提取器（專利號CN2017-20660247.5）：吉林化工學院自制；P230P型高效液相色譜 （high performance liquid chromatography，HPLC）儀：大連依利特分析儀器有限公司；PinnacleⅡC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：RESTEK 公司；RE-52C旋轉蒸發儀：鞏義市予華儀器有限責任公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5的 HPLC 標準曲線繪制

精密稱量人參皂苷對照品20（S）-Rg3 1.926 mg、20（R）-Rg3 1.940 mg、Rg5 2.032 mg，用甲醇定容至10 mL，配成人參皂苷單體對照品儲備液，從中分別準確移取2.5、1.0、0.5、0.25 mL溶液用甲醇定容至 10 mL，配制成5種不同質量濃度的人參皂苷對照品溶液。人參皂苷對照品溶液經0.45 μm濾膜過濾后，進行高效液相色譜分析，并以人參皂苷濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3 人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的制備方法

在多功能改進型索氏提取器的提取筒中放入過100目篩人參須根粉2 g，在提取筒和圓底燒瓶中分別加入20 mL不同濃度的乙醇水溶液，取新鮮的檸檬汁[23]加至圓底燒瓶中并放入攪拌轉子，安裝索氏提取裝置。將裝置中的圓底燒瓶置于不同溫度的油浴中，并在提取筒中通入預先加熱到特定溫度的導熱液，200 r/min下加熱攪拌提取。當提取筒出現回流液時打開提取筒下端活塞，并保持液面至提取達到動態平衡。提取結束，提取液冷卻，離心，取上清液，固體殘渣用10 mL的甲醇分兩次洗滌，離心，與上清液合并。上清合并液經充分混合，移取1/25合并液，小心滴加飽和碳酸鈉至pH6，旋蒸至干。殘留物中加入4 mL的甲醇，超聲溶解，用0.45 μm濾膜過濾，進行HPLC分析，并計算人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的總得率，計算公式如下。

Y/%=m/M×100

式中：Y為總得率，%；m為所提稀有人參皂苷質量，g；M為人參須根粉質量，g。

稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的制備原理見圖1。

圖1 稀有人參皂苷20(S，R)-Rg3和Rg5的制備原理Fig.1 Preparation principle of rare ginsenosides 20(S，R)-Rg3 and Rg5

1.3.4 正交試驗優化提取制備20（S，R）-Rg3、Rg5的工藝條件

在單因素試驗的基礎上，為了進一步優化反應條件，在檸檬汁用量2 mL、油浴溫度135℃的條件下，選取乙醇濃度（A）、提取時間（B）、提取筒溫度（C）3個因素，每個因素選取3個水平進行L9（34）正交試驗，確定最優試驗方案。因素與水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素與水平Table 1L9（34）orthogonal experimental factors and levels

1.3.5 HPLC分析方法

本試驗按照文獻[24]的色譜條件進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

將 1.3.2 配制的人參皂苷的 20（S）-Rg3、20（R）-Rg3、Rg5的標準品儲備液進行HPLC定量分析，以人參皂苷標準品的質量濃度為橫坐標X（μg/mL），以峰面積為縱坐標 Y（mV）繪制標準曲線，得 20（S）-Rg3、20（R）-Rg3和Rg5的回歸方程及R2值如下。

Y20（S）-Rg3＝7.425 8X＋0.861，R2＝0.999 9

Y20（R）-Rg3＝8.376 0X-6.340 2，R2＝0.999 9

YRg5＝16.883 0X-40.53，R2＝0.999 6

結果顯示 20（S）-Rg3、20（R）-Rg3 和 Rg5 的標準曲線線性關系良好，可信度較高。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 得率的影響

分別以20%、30%、40%、50%、60%的乙醇水溶液為提取溶劑，在提取筒溫度65℃，油浴溫度125℃下提取3 h，考察乙醇濃度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響，結果見圖2。

圖2 乙醇濃度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of ginsenoside 20（S，R）-Rg3 and Rg5

圖2表明，乙醇濃度為20%時，人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率最低，30%時總得率最高。而當乙醇濃度進一步升高時，20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率呈整體下降的趨勢。分析原因，可能是由于多功能改進型索氏提取器在循環提取過程中，同時可以實現動態的梯度提取。乙醇溶液汽化時氣相組分中醇濃度會增大，導致提取過程中提取溶劑的極性由高逐漸轉低，根據“相似相溶”原理，不同極性溶劑的梯度提取可能更有助于多種極性的人參皂苷通過結構修飾轉化為 20（S，R）-Rg3 和 Rg5。與文獻[25-26]中報道的人參皂苷最佳提取乙醇濃度（70%～80%）相比，該工藝所需乙醇濃度僅為30%，因此可以節省乙醇溶劑的使用。

2.2.2 檸檬汁用量對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響

檸檬汁中含有豐富的檸檬酸，此外還含有酒石酸和蘋果酸，均可以在水中解離質子催化人參皂苷的結構修飾反應。以30%的乙醇水溶液為提取溶劑，分別加入 0.5、2.0、3.5、5.0、6.5 mL 檸檬汁，在提取筒溫度65℃，油浴溫度125℃下提取3 h，考察不同檸檬汁用量對人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 得率的影響，結果見圖3。

圖3 檸檬汁用量對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響Fig.3 Effect of lemon juice dosage on yield of ginsenoside 20（S，R）-Rg3 and Rg5

圖 3 表明，人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的總得率在0.5 mL～2.0 mL范圍內隨著檸檬汁用量的增加而增加，2.0 mL～5.0 mL范圍內幾乎保持不變，進一步提高檸檬汁用量，總得率有所下降。這說明檸檬汁用量為2.0 mL～5.0 mL 時比較適合人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5的制備，如果過少，酸催化能力下降，總得率低；若過多，會導致人參皂苷Rg5部分分解，使總得率下降。

2.2.3 油浴溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響

以濃度30%的乙醇水溶液為提取溶劑，在提取筒溫度 65℃下，分別在 105、115、125、135、145℃油浴溫度下提取3h，考察不同油浴溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響，結果見圖4。

圖4 油浴溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響Fig.4 Effect of oil bath temperature on yield of ginsenoside 20（S，R）-Rg3 and Rg5

由圖 4可見，油浴溫度為 105℃時，20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率只有0.14%，這是因為105℃油浴溫度下提取溶劑較難進行汽化，無法完成動態循環提取，致使所提人參皂苷少，故20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率也隨之減少。隨著油浴溫度的提高，提取溶劑循環速度加快，20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率也逐漸增加，當油浴溫度為135℃時，其總得率達到最大值3.03%；而進一步提高油浴溫度，皂苷總得率反而下降。

2.2.4 提取筒溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響

以濃度為30%的乙醇水溶液為提取溶劑，提取筒溫度分別設置為 35、45、55、65、75℃，在油浴溫度 135℃下提取3h，考察不同提取筒溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響，結果如圖5所示。

圖5 提取筒溫度對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響Fig.5 Effect of extraction cylinder temperature on yield of ginsenosides 20（S，R）-Rg3 and Rg5

隨著提取筒溫度從35℃到75℃不斷升高，人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5 的總得率也隨之增加，這是因為提取筒溫度升高，人參皂苷在提取溶劑中的溶解度增加，在相同時間內可以提取更多人參皂苷，這就可以使較多的人參皂苷轉化成稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5。

2.2.5 提取時間對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響

以濃度為30%的乙醇水溶液為提取溶劑，在提取筒溫度75℃，油浴溫度135℃下分別提取1、2、3、4、5h，考察不同提取時間對人參皂苷 20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響，結果見圖6。

圖6 提取時間對人參皂苷20（S，R）-Rg3、Rg5得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on yield of ginsenosides 20（S，R）-Rg3 and Rg5

在提取時間 1 h～4 h 范圍內，20（S，R）-Rg3、Rg5的總得率隨著提取時間的增加呈增長趨勢，當提取時間進一步延長至5 h時，人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率略有下降，可能是持續高溫會導致副反應發生。考慮到實際操作及能源節約的角度，選擇3 h為皂苷最佳提取時間。

2.3 正交試驗結果

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

由表2可知，乙醇濃度（A）、提取時間（B）和提取筒溫度（C）的極差R分別為0.81、0.99和0.27，說明影響20（S，R）-Rg3和Rg5總得率的因素主次順序為B（提取時間）>A（乙醇濃度）>C（提取筒溫度）。最優組合方案為A2B3C1，即乙醇濃度30%、提取時間4 h、提取筒溫度75℃。按最優方案進行3次重復性驗證試驗，所得稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的總得率分別為3.69%、3.71%和3.72%，表明工藝穩定可行。

圖7是優化條件下不加入檸檬汁和加入檸檬汁提取人參皂苷時人參提取物的HPLC分析圖。

圖7 人參須根粉提取物的HPLC分析圖Fig.7 HPLC analysis chart of fine ginseng root powder extract

由圖7可知，無檸檬汁加入時，提取得到的是原人參二醇組皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 以及原人參三醇組皂苷 Rg1 和 Re，而加入檸檬酸提取時，Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd以及Rg1和Re的吸收峰明顯變小或消失，而在保留時間約65 min～67 min和80 min時，出現明顯的稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的吸收峰，這說明檸檬汁的加入可以很好地通過結構修飾將提取皂苷轉化成目標產物稀有皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5。

結果表明，當人參須根粉中的原人參二醇組皂苷完全轉化成20（S，R）-Rg3和Rg5時，理論計算得率在2.86%～2.93%之間，而在相同提取條件下 20（S，R）-Rg3和Rg5的實測總得率為3.68%，明顯高于理論計算值。分析原因，可能是因為人參中不僅含有常見的原人參二醇組皂苷，還含有極性更大的丙二酸單酰基人參皂苷，當利用多功能改進型索氏提取器對人參須根粉進行提取時，提取桶內乙醇濃度不斷變化，可以實現對不同極性人參皂苷和丙二酸單酰基人參皂苷的梯度提取，而丙二酸單酰基人參皂苷在檸檬汁作用下會水解生成相應的人參皂苷，進而提高稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和 Rg5的總得率。

3 結論

本文利用多功能改進型索氏提取器，在檸檬汁催化下從人參須根粉中提取制備稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5。試驗過程具有溶劑循環提取、溶劑梯度提取、連續動態提取、綠色催化、固液分離等特點，可以有效提高稀有人參皂苷20（S，R）-Rg3和Rg5的制備效率。利用多功能改進型索氏提取器，既能對不同極性的人參皂苷進行高效梯度提取和轉化，又能減少醇類提取劑的使用，同時試驗操作簡單，環境友好，實現了提取和結構修飾的有機結合，這對于高附加值稀有人參皂苷的大量制備以及相關產品的開發具有重要借鑒意義。