蜂王幼蟲凍干粉對PCPA失眠小鼠的改善作用

唐啟河，廖世群，王佳炫，蕭楊，陳奕霏，曹喆，田文禮，郭軍*

（1.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500；2.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093）

在臨床中，失眠是最常見的疾病之一，也是最常見的睡眠障礙[1]。全球的睡眠調查顯示，約有4%～22%的歐洲人、18%～23%的日本人、33%的美國人和42.5%的中國人受失眠困擾[2]。對狗、老鼠、蟑螂和蒼蠅等動物模型的失眠研究表明，睡眠不足可能導致這些生物過早死亡；大量的臨床和試驗研究都將睡眠不足與認知功能損傷、胃腸道、免疫、代謝和循環系統功能障礙等健康問題聯系在一起[3]。此外，失眠也是焦慮、抑郁、精神分裂癥和自殺等精神疾病的早期臨床指標[4]。因此，有效地預防和治療失眠是當今全球的研究熱點之一[5]。目前臨床使用的抗失眠藥物主要為化學合成的西藥，如苯二氮卓類受體激動劑[1]。然而，西藥的治療效果并不令人滿意，這些藥物隨著時間的推移還會產生副作用、依賴性和耐受性[1，6]。因此，近年來，研究人員開始從天然的材料中尋找具有治療失眠作用的物質，如由黃連和肉桂兩種中藥組成的制劑——交泰丸對失眠具有顯著的治療作用[1]。但現在報道的具有治療失眠作用的天然物質都集中在中藥等植物類物質[1-2，6]，而對于其它的天然物質還鮮有報道。

蜂王幼蟲，又稱蜂王胎，是蜜蜂的受精卵孵化后取食新鮮的蜂王漿發育而成的[7]，是蜂王漿生產過程中的副產品[8]，也是一種重要的天然蜂產品。我國作為世界第一的養蜂大國，蜂王幼蟲的年產量可達600 t左右[9]。相關研究發現，蜂王幼蟲含有豐富的必需氨基酸和蛋白質，其中粗蛋白含量占其干重的50%～60%左右，蛋白質含量高于蜂王漿，且其還含有多種維生素和生物活性酶等成分[8，10]。隨著對蜂王幼蟲產品的不斷開發，逐漸地發現蜂王幼蟲具有提高免疫力[7-8]、抗氧化[11]、延緩衰老[12]和抗疲勞[13]等保健功效。研究發現免疫系統失調會影響睡眠質量[14]，蜂王幼蟲是否會通過增強免疫力來治療失眠小鼠的睡眠作用還未見報道，因此本研究通過對氯苯丙氨酸（p-chlorophenylalanine，PCPA）構建失眠小鼠模型，探究飼喂蜂王幼蟲凍干粉制劑對失眠小鼠的治療效果，以期尋找到可治療失眠的天然無副作用的新型抗失眠產品，為進一步將蜂產品往功能食品方向研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

小鼠：昆明醫科大學。昆明種雄性小鼠30只，SPF級，體重（20±2）g，將其飼養于昆明理工大學生命科學與技術學院動物房內，環境溫度為室溫（25±2）℃，相對濕度為55%～65%，分籠飼養，正常采光。小鼠適應飼養7 d，期間自由攝食與飲水，水源為純凈水，飼料為實驗鼠維持飼料。

1.1.2 材料與儀器

蜂王幼蟲凍干粉：云南老滇凰食品有限公司；實驗鼠維持飼料：江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司；小鼠 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯免疫吸附測定試劑盒：江蘇晶美生物科技有限公司；生理鹽水、PCPA：上海源葉生物科技有限公司。

ES2000-2電子天平：沈陽德克天平有限公司；RT-6500酶標儀：上海雨辰生物技術有限公司；JK23116小鼠灌胃針：北京精凱達有限公司。

PCPA注射液：稱取PCPA粉末適量，用弱堿性的生理鹽水（pH 7～8）配成質量濃度為50 mg/mL的混懸液。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠分組及處置

小鼠適應飼養7 d后，在第8天將小鼠隨機分成空白對照組、失眠模型組、低劑量蜂王幼蟲凍干粉給藥治療組（0.1 g/kg）、中劑量蜂王幼蟲凍干粉給藥治療組（1g/kg）和高劑量蜂王幼蟲凍干粉給藥治療組（10g/kg），每組6只。連續2 d對失眠模型組和蜂王幼蟲凍干粉給藥治療組小鼠腹腔注射PCPA[400 mg/（kg·d）]，空白對照組小鼠平行注射等體積的弱堿性生理鹽水。在最后一次腹腔注射PCPA混懸液24 h后，對小鼠的活動進行監測，以尋找建立失眠模型成功的證據，失眠模型包括晝夜節律喪失、興奮性增強、攻擊性增強、尿和糞便的產生增多、毛發散亂和暗沉以及糞便灰白色，模型建立前后用電子天平給小鼠稱重[4]。此外，通過檢測小鼠血清中5-HT含量來判斷造模是否成功，造模小鼠的血清中5-HT的相對體重含量顯著低于空白對照組，則造模小鼠被視為失眠小鼠[6]。造模成功后，每日上午9點～10點進行灌胃給藥治療，空白對照組和失眠模型組灌胃等量去離子水，連續處理7 d，每天灌胃處理后將小鼠放回籠內，籠內放置鼠糧和水，保證各組小鼠能正常自由飲食。

1.2.2 樣品采集及處理

治療7 d后采用斷頭法處死小鼠，在4℃環境下立即將每只小鼠的心臟、肝、脾、肺及腎等進行解剖并稱重，計算出小鼠體重和臟器系數[15]。收集小鼠血清并保存在-80℃備用，將收集到的小鼠血清按試劑盒說明書進行操作，測定小鼠血清中5-HT含量，計算出血清中5-HT的相對體重含量，其中血清中5-HT的相對體重含量/[pg/（mL·g）]=血清中5-HT含量（pg/mL）/小鼠體重（g）。

1.3 數據分析

采用GraphPad Prism 8.3.0和SPSS Statistics 18軟件對數據進行差異性分析和作圖，P＜0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 失眠模型的驗證

造模后小鼠血清中5-HT的相對體重含量見圖1。

圖1 造模后小鼠血清中5-HT的相對體重含量Fig.1 Relative body weight content of 5-HT in serum of mice after modeling

如圖1所示，與空白對照組相比，其余4組造模小鼠血清中5-HT的相對體重含量明顯下降（P＜0.05）；在連續2 d造模后，與正常小鼠相比，4組造模小鼠的體重也都明顯下降。此外，造模后通過對小鼠行為學觀察，發現造模小鼠集中表現為攻擊性增強、毛發粗糙暗沉、警惕性變高、尿液和糞便增多、晝夜節律消失等癥狀，符合失眠模型的行為特征。從以上結果可以得知本研究中失眠小鼠模型構建成功。

2.2 蜂王幼蟲凍干粉對失眠小鼠的治療效果

2.2.1 行為學指標檢測

不同飼喂條件下小鼠體重變化見圖2。

圖2 不同飼喂條件下小鼠體重變化Fig.2 Body weight changes of mice under different feeding conditions

如圖2所示，第1天～第2天為造模處理時期，第3天造模處理結束，同時從第3天起開始飼喂蜂王幼蟲凍干粉，從圖2可以看出，由于造模處理，小鼠在最初3 d體重急劇下降，從第4天起，在飼喂治療7 d內，所有飼喂蜂王幼蟲凍干粉組小鼠的體重均開始平穩增長，只有空白對照組體重一直保持增長，未出現體重下降的現象。此外，行為學觀察表明，小鼠在治療期間，攻擊性明顯減弱、皮毛逐漸潔凈、白天睡眠增多、不易驚醒，相對于失眠模型組尿量減少，大便正常，晝夜節律恢復，睡眠時間也相應增加。

2.2.2 蜂王幼蟲凍干粉治療后血清中5-HT的相對體重含量測定

蜂王幼蟲凍干粉治療后小鼠血清中5-HT的相對體重含量見圖3。

圖3 小鼠血清中5-HT的相對體重含量Fig.3 Relative body weight content of 5-HT in mouse serum

如圖3所示，與空白對照組相比，高、中、低劑量蜂王幼蟲凍干粉治療組小鼠血清中5-HT的相對體重含量無明顯差異，表明經蜂王幼蟲凍干粉治療后可有效改善失眠小鼠的睡眠；而失眠模型組的小鼠血清中的5-HT相對體重含量與空白對照組相比呈顯著降低（P＜0.05），這一結果也充分表明失眠模型構建成功。蜂王幼蟲凍干粉灌胃7 d小鼠血清中5-HT的相對體重含量見表1。

表1 蜂王幼蟲凍干粉灌胃7 d小鼠血清中5-HT的相對體重含量Table 1 Relative body weight content of 5-HT in serum of mice after intragastric admiistration of lyophilized powder of queen bee larvae for 7 days

從表1可以看出，高、中、低劑量蜂王幼蟲凍干粉治療組與失眠模型組的小鼠相比，血清中的5-HT相對體重含量明顯增高（P＜0.05），充分說明蜂王幼蟲凍干粉對PCPA失眠小鼠有治療失眠的效果。

2.2.3 蜂王幼蟲凍干粉治療對小鼠五臟的影響

蜂王幼蟲凍干粉對失眠小鼠治療7 d后，小鼠的體重和器官系數，如表2所示。

表2 蜂王幼蟲凍干粉灌胃7 d后的小鼠臟器系數Table 2 Viscera coefficient of mice fed freeze-dried powder to queen bee larvae for 7 days mg/g

由表2可知，與空白對照組相比，3個治療組的肺和腎的臟器系數并無顯著差異；失眠會造成心臟和肝器官的變重，而灌胃蜂王幼蟲凍干粉可使這兩個器官的質量趨于正常，尤其是灌胃高劑量蜂王幼蟲凍干粉的小鼠，心臟和肝器官質量降低更加顯著（P＜0.05）；與失眠模型組相比，灌胃高劑量的蜂王幼蟲凍干粉會造成小鼠脾臟器官的質量顯著增加（P＜0.05）。

3 討論與結論

PCPA被廣泛應用于失眠動物模型的建立，它是5-HT生物合成中的起始酶和限速酶—色氨酸羥化酶的選擇性和不可逆抑制劑，其會通過抑制色氨酸羥基化而阻斷5-HT的合成，可顯著降低腦內和外周血中的5-HT含量[16-17]。而5-HT在睡眠-覺醒調節中發揮著關鍵作用，5-HT含量降低會造成動物失眠[18]。在本實驗中，對小鼠連續2 d注射PCPA進行失眠模型的建立，通過對血清中5-HT的檢測，發現注射過PCPA組的小鼠血清中5-HT的相對體重含量都顯著低于空白對照組的小鼠，說明本次實驗中失眠小鼠模型構建成功。此外，通過對小鼠行為的檢測，也證實小鼠失眠模型建立成功。相關研究發現，PCPA注射后，5-HT含量至少在1周內都會保持較低水平[19]。因此，本實驗通過對失眠模型小鼠連續7 d灌胃高、中、低劑量的蜂王幼蟲凍干粉，進一步觀察蜂王幼蟲凍干粉對失眠的治療和改善效果。研究也表明，失眠模型組小鼠的血清中5-HT相對體重含量與空白對照組相比差異顯著（P＜0.05），而治療后的小鼠血清中的5-HT的相對體重含量與失眠模型組相比明顯升高（P＜0.05），且3組灌胃治療組的小鼠的血清中5-HT的相對體重含量與空白對照組中小鼠已無明顯差異，這些結果充分說明蜂王幼蟲凍干粉對失眠小鼠具有明顯的改善作用。

實驗中PCPA造模的失眠小鼠其心臟和肝臟質量出現了明顯增加，而飼喂蜂王幼蟲凍干粉治療后會減輕這兩個器官增加的質量，尤其是高劑量蜂王幼蟲凍干粉治療的小鼠心臟和肝臟質量與失眠模型組的小鼠出現了顯著降低（P＜0.05），而與空白對照組已無明顯差異，表明蜂王幼蟲凍干粉對失眠帶給小鼠器官的負面影響具有改善作用。在一項對失眠人群的研究中發現失眠會導致患非酒精性脂肪肝的風險增加[20]，而非酒精性脂肪肝通常表現為肝臟脂肪積累增多變重[21]，因此，失眠模型小鼠肝臟質量增加可能是患非酒精性脂肪肝的前兆。在對失眠小鼠飼喂高劑量蜂王幼蟲凍干粉后，其脾臟與其它組小鼠相比明顯變重，而脾臟是重要的免疫器官，在免疫應答方面起著重要作用[22]。這說明高劑量蜂王幼蟲還會提高小鼠的免疫力，這與周瑞華等[7]的研究結果相一致。蜂王幼蟲在整個生命階段都會一直取食蜂王漿[23]，因此，本研究中飼喂失眠小鼠的蜂王幼蟲凍干粉中也含有蜂王漿的一些營養成分，最近有研究發現，蜂王漿中的王漿主蛋白具有改善免疫的作用[24]，蜂王幼蟲能增強小鼠免疫力很可能是王漿主蛋白發揮了重要作用。

免疫系統對睡眠有著重要的調節作用[14]，研究發現一些免疫細胞因子、褪黑素和生長激素等都參與了睡眠調節，若免疫系統功能發生失調，這些細胞因子等就會發生失調，從而引起睡眠障礙[22，25-26]。蜂王幼蟲凍干粉中除了含有可增強免疫力的王漿主蛋白，還含有蜂蛹多肽等肽類物質，研究發現蜂蛹多肽可增強RAW264.7巨噬細胞的免疫活性[27]，因此，蜂王幼蟲可改善失眠小鼠的睡眠作用，很可能是通過蜂王幼蟲凍干粉中的活性蛋白（如王漿主蛋白）和蜂蛹多肽等肽類物質的綜合作用提高和改善了小鼠的免疫力，從而達到治療失眠的作用。另外，相關研究發現腸道微生物受到睡眠質量影響，睡眠不足會改變腸道正常菌群[28]，而通過調節失眠小鼠腸道菌群的結構和組成，來增加腸道菌群中有益菌群的比例，可有效改善小鼠的睡眠作用[29]，蜂王幼蟲凍干粉可能也會通過改變失眠小鼠的腸道菌群來改善睡眠作用，但還需要進一步實驗來驗證。

綜上所述，本研究發現蜂王幼蟲具有改善PCPA失眠小鼠的作用，蜂王幼蟲凍干粉改善失眠小鼠的睡眠作用可能是通過提高小鼠免疫力等機制來實現的，但蜂王幼蟲凍干粉改善失眠小鼠的具體機制還需要進一步深入研究。