基于網絡藥理學探討通竅活血湯治療顱腦損傷的作用機制

杜勇 張淑敏 王雷 王文鑫 東瀟博 劉佳霖 蔡旭 陳嘉琪 王革生

摘要 目的：基于網絡藥理學探討通竅活血湯治療顱腦損傷（TBI）的作用機制。方法：通過檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫篩選出通竅活血湯潛在活性成分及靶點，采用GeneCard與OMIM數據庫獲得顱腦損傷疾病靶點，得到通竅活血湯的中藥與TBI的交集靶點，使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制活性成分靶點疾病交互網絡圖。采用String數據庫構建靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，并進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析。結果：篩選后收集得所有中藥成分127個，收集疾病靶點1 811個，疾病與藥物交集靶點共62個。PPI網絡提示核心靶點為ALB、IL6、CASP3、EGFR、VEGFA等;GO功能注釋得到73條富集結果，包括DNA結合轉錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性等，富集得到PI3K-AKT等75條核心的KEGG通路。結論：通竅活血湯治療顱腦損傷具有多成分、多靶點、多通路的作用機制特點。

關鍵詞 通竅活血湯;顱腦損傷;網絡藥理學;靶點;蛋白互作網絡;信號通路;富集分析;作用機制

Action Mechanism of Tongqiao Huoxue Decoction in the Treatment of Traumatic

Brain Injury Based on Network Pharmacology

DU YONG1，ZHANG Shumin2，WANG Lei1，WANG Wenxin1，DONG Xiaobo1，

LIU Jialin1，CAI Xu1，CHEN Jiaqi3，WANG Gesheng1

（1 Dongfang Hospital Beijing University of Chine Medicine，Beijing 100078，China; 2 Civil Aviation General Hospital，

Beijing 100123，China; 3 Beijing University of Chine Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Tongqiao Huoxue Decoction in the treatment of craniocerebral injury based on network pharmacology.Methods：The potential active ingredients and targets of Tongqiao Huoxue Decoction were screened by searching the TCMSP database，and the target diseases of brain injury were obtained using GeneCard and OMIM database，and the intersection target of the Chinese medicinal of Tongluo Huoxue Decoction and TBI intersection target were obtained.Cytoscape 3.7.2 software was used to draw the interactive network diagram of the active ingredient target disease.The String database was used to construct the target interaction PPI network，and the GO function enrichment analysis and KEGG signal pathway enrichment analysis were performed.Results：A total of 127 Chinese medicinal components were collected，1811 disease targets were collected，and a total of 62 disease and drug intersection targets were collected.The PPI network suggested that the core targets were ALB，IL6，CASP3，EGFR，VEGFA，etc.; GO function annotations yielded 73 enrichment results，including DNA binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ transformation，etc.，enrichment yielded PI3K-AKT，etc.and 75 core KEGG pathways.Conclusion：Tongqiao Huoxue Decoction has the characteristics of multi-component，multi-target and multi-path mechanism in the treatment of craniocerebral injury.

Keywords Tongqiao Huoxue Decoction; Traumatic brain injury; Network pharmacology; Targets; Protein protein interaction network; Signal pathway; Enrichment analysis; Mechanism of action

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.012

創傷性顱腦損傷（Traumatic Brain Injury，TBI）是創傷患者死亡和致殘的主要原因，為臨床常見疾病[1-3]。由于TBI治療難度大、治療費用高，致殘率與致死率均較高，給患者個人及其家庭在經濟、精神上造成巨大負擔[1，4-5]。西醫治療上，TBI可分為內科保守常規治療和外科手術治療。而TBI的中醫治療亦具有豐富的臨證經驗，但未形成系統的規范指導體系，因此關于中醫藥治療TBI以降低死亡率、致殘率，改善預后、提高生命質量的研究意義重大。

TBI沒有中醫對應的具體病名，可歸屬中醫學“外傷性腦病”“頭部內傷病”等范疇。腦為元神之府，諸陽之匯，遭受外傷后，氣滯血瘀，阻塞清竅，腦氣逆亂，神明擾亂，神機失用為其主要發病機制。臟腑功能失調，正氣受損，痰瘀阻絡，為虛實夾雜之證。但瘀血阻滯則貫穿整個疾病過程。歷代醫家也認可在臨床上應用活血化瘀法治療顱腦損傷[6]。近年來，活血化瘀中藥治療廣泛應用于顱腦損傷的救治;王永忠和伍世杰[7]通過臨床觀察發現在西醫治療的基礎上配合以“活血化瘀”法為主中藥治療急性期腦挫裂傷對促進早期清醒，降低致殘率方面有明顯療效。而徐澤彪等[8]通過臨床觀察更是發現通竅活血湯可以促進顱腦損傷后患者腦血流的恢復、減輕腦血管痙攣，從而達到改善患者預后的效果，并且沒有誘發再出血的風險。通竅活血湯由清·王清任所創，由赤芍，川芎，桃仁，紅花等藥物組成，具有活血化瘀，通竅活絡的作用，現代藥理學研究證實：桃仁、紅花、川芎、赤芍等的有效成分苦杏仁苷、紅花苷、川芎嗪等能通過血腦屏障，改善顱內血液循環，提高腦部新陳代謝，以增強其對缺氧的耐受性[9]。上述諸藥合用可增加腦血管血流量，改善腦細胞血液循環及缺氧狀態[10]，從而加速顱內血腫吸收，減輕腦組織因炎癥反應所致的腦組織水腫，從而緩解顱高壓，促進機體神經功能的恢復，減低死亡率，提高生存率。而且目前通竅活血湯在創傷性顱腦損傷所致的腦外傷綜合征、神昏以及情志障礙方面的防范應用已達成共識[11]。近期研究揭示了通竅活血湯改善顱腦損傷的作用機制為通過激活線粒體自噬從而抑制細胞凋亡的發生，為顱腦損傷的臨床治療提供新的實驗支持和理論依據[12]。但是通竅活血湯治療TBI的關鍵作用靶點、信號通路目前仍不十分清楚，有待進一步研究。融合系統生物學和多向藥理學提出的網絡藥理學可構建藥物-靶點-疾病之間的復雜網絡，利用網絡分析理論從整體角度研究藥物作用機制。運用絡藥理學預測通竅活血湯對TBI干預與影響的相關成分與靶點及通路，從整體探討藥物對TBI的調控作用，為進一步闡明其活性成分、作用靶點以及發揮臨床療效的科學內涵提供依據，探索TBI治療的新作用靶點與信號通路，并為后續研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 藥物相關活性成分及藥物靶點的篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）將通竅活血湯中的主要中藥（桃仁、紅花、川芎、赤芍、蔥白、生姜、大棗）進行成分檢索，獲取每個中藥對應的成分編號，根據對應的口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）值，以OB≥30%，DL≥0.18作為標準，篩選出候選活性成分并整理對應藥活性成分及潛在靶點信息，然后把獲得的靶點蛋白名通過UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）轉換為基因名。

1.2 核心靶點篩選與“活性成分-作用靶點-疾病”網絡的構建

將“Traumatic Brain Injury”作為關鍵詞在OMIM（http：//www.omim.org/）與Genecards（https：//www.genecards.org/）數據庫檢索TBI疾病靶點信息，之后與中藥活性成分靶點比對獲取交集靶點，以此繪制成通竅活血湯中藥活性成分靶點和TBI疾病靶點交集韋恩圖。然后在Cytoscape 3.7.2軟件中構建“中藥活性成分-潛在靶點”“中藥-重要活性成分-疾病靶點”作用網絡圖。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

獲得TBI與通竅活血湯的交集靶點后，使用STRING 11.0數據庫（https：//string-db.org/）構建PPI網絡圖，分析條件設置如下：蛋白質種類設置為“homo sapiens（人類）”，作用閾值設置為“medium confidence（中等）”，其他條件維持設置默認。根據PPI網絡中靶點的Count值作為依據篩選重要靶點蛋白，并進行相應分析。

1.4 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

獲得通竅活血湯與TBI共同作用靶點蛋白后，進行GO富集功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析，探討通竅活血湯治療TBI的重要生物學過程與相關信號通路。從KEGG富集的結果中篩選具有統計學意義（P<0.01）的信號通路，分析該關鍵靶標和關鍵信號通路的含義，利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“KEGG信號通路-作用靶點”網絡圖。

2 結果

2.1 活性成分

共檢索通竅活血湯的中藥成分共1 065個，其中桃仁66個、紅花189個、川芎189個、赤芍119個、蔥白104個、生姜265個、大棗133個活性成分。篩選后收集得所有中藥成分127個，其中桃仁23個、紅花22個、川芎9個、赤芍29個、蔥白10個、生姜5個、大棗29個活性成分。見表1。包括鞣花酸、芍藥苷、黃芩素、楊梅酮、谷甾醇、豆甾醇等。去除重復后中藥靶點有122個，收集疾病靶點1 811個，疾病與藥物交集靶點共62個。見圖1。

2.2 中藥有效成分-靶點網絡圖與疾病-成分-靶點網絡圖構建

Cytoscape 3.7.2繪制中藥有效成分-靶點網絡圖，圖中顯示106個節點，240條邊。見圖2。繪制疾病-成分-靶點網絡圖中有118個節點，407條邊。見圖3。

2.3 PPI網絡構建

將62個交集靶點導入String數據庫獲取的相互作用關系的PPI網絡。見圖4。根據Count值大小排列前40個核心靶點。見表2。其中ALB、IL6、CASP3、EGFR、VEGFA為Count值最大的前5個靶點。

2.4 GO富集結果

GO富集相關73個條目。見表3。包括DNA結合轉錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性，細胞黏附分子結合，類固醇結合，內肽酶活性，類固醇激素受體活性等。

2.5 KEGG富集結果

KEGG富集結果共獲75條相關通路。根據Count值大小從中篩選前20條有顯著意義的富集信號通路。見表4。并用氣泡圖表示。見圖5。繪制通路與靶點相互作用的網絡關系。見圖6。其中PI3K-AKT、Kaposi sarcoma-associ-ated herpesvirus infection、Human cytomegalovirus in-fection、Fluid shear stress and atherosclerosis、Proteoglycans in cancer等與TBI關系最為密切。

3 討論

TBI的發病機制較為復雜[13]，包括原發性損傷和繼發性損傷，但皆為外傷造成的暫時性或永久性的神經元損傷。其中原發性損傷是指外力直接打擊造成的顱腦損傷，而繼發性損傷發生是指在原發性損傷的基礎上，因分子、化學物質以及炎癥的級聯反應造成的再次腦組織損傷，如神經元去極化，使細胞內鈣離子水平升高，進而激活蛋白酶、自由基等發生細胞凋亡，損傷神經細胞;炎癥反應的發生能使更多神經元損傷、血腦屏障破壞以及腦水腫，引起凝血酶激活、炎癥反應、紅細胞溶解[14]，繼而形成細胞凋亡、炎癥、神經細胞壞死等最終導致神經功能障礙[15-17]。

我們通過網絡藥理學研究方法對通竅活血湯治療TBI的作用機制進行了分析，共獲得127個有效成分，62個作用靶點，75條相關信號通路。中藥有效成分包括鞣花酸、芍藥苷、黃芩素、黃芩苷、β-谷固醇、阿魏酸等，其中鞣花酸具有抗氧化作用，對內皮功能障礙治療、維持氧化還原平衡起作用[18-19];實驗表明芍藥苷對于小鼠腦損害的微血管內皮細胞具有保護作用[20];黃芩素具有抗炎、抗凋亡、抗氧化應激以及刺激神經發生和促進神經保護因子的表達等多種藥理活性[21];有實驗證明黃芩苷可顯著抑制PI3K、AKT、GSK-3β的水平，對于凋亡生物過程起干預作用[22];植物固醇中的β-谷固醇直接或間接影響腦組織中關鍵物質的合成，進而可能影響大腦功能[23]，從而改善TBI治療預后;阿魏酸具有抗炎和神經保護作用等多種特性，能夠通過抑制小膠質細胞的過度激活來緩解炎癥反應，減輕腦水腫，改善記憶功能，起到神經保護作用[24]。上述表明通竅活血湯中各藥材在TBI治療中的共同協同作用，體現了中藥多成分協同保護神經的特性。

PPI網絡拓撲學分析結果顯示，ALB、IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA為前5位的重點靶點。ALB是血漿中最主要的功能性蛋白，與患者機體損傷存在密切相關性，維持血漿ALB水平有助于改善TBI預后[25]。IL-6是經典的炎癥指標，在腦損傷患者中，腦脊液和血清IL-6顯著上調與急性期反應和腦脊液中神經生長因子的釋放有關[26]。CASP3對調控細胞凋亡有重要作用，與凋亡誘導因子起相互作用[27]。內皮生成因子VEGFA有維護內皮細胞完整，調控血管內皮細胞生成、修復受損血管的作用，并且通過壞死物的清除與氧和代謝物的交換，以輔助神經功能的修復[28]。表皮生長因子（EGF）及其受體EGFR在炎癥反應、活性氧生成、髓鞘脫失和神經元修復過程中發揮作用，與中樞神經系統損傷和修復相關[29-30]。ALB、CASP3、IL-6、EGFR與VEGFA上述5個核心靶點總體上與炎癥、血管、神經功能調節、凋亡等相關，表明通竅活血湯的作用機制與上述生物功能相關。GO富集分析所得到的生物過程涉及DNA結合轉錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性，細胞黏附分子結合，類固醇結合，內肽酶活性，類固醇激素受體活性，GO富集分析所得到的生物過程涉及DNA、RNA，細胞因子、炎癥反應、免疫反應，提示通竅活血湯通過上述生物過程治療TBI。KEGG信號通路分析示PI3K-AKT為主要信號通路。PI3K-AKT為凋亡信號通路，實驗發現PI3K/AKT信號通路調節TBI大鼠腦皮質區凋亡水平，側面證實PI3K/AKT信號通路發揮抗凋亡作用[31];黃芩素具有調控包括血管生成和促進凋亡的生物學作用，并且可能與其具有抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路的作用有關[32]。本研究預測通竅活血湯很可能是通過相關通路直接或間接地作用于某些靶點而發揮作用，具體的調節機制還需進一步實驗的驗證。

4 結語

綜上所述，網絡藥理學能夠從整體把握中藥治療疾病的有效成分、關鍵作用靶點及主要信號通路，通過本研究，我們發現通竅活血湯療TBI作用機制中，主要通過中藥中芍藥苷、黃芩素等成分對ALB、IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA等靶點發揮作用，其中PI3K-AKT為最主要的信號通路，推測其在抑制細胞凋亡與炎癥，保護神經細胞中發揮重要作用，從而抑制TBI病理發展過程，這也為后續研究通竅活血湯治療TBI提供了實驗研究方向。

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（2020-09-10收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家中醫藥管理局國家中醫臨床研究基地業務建設科研專項課題（JDZX2015043）——破血化瘀法治療出血性中風急性期干預時點及風險的研究;北京中醫藥大學2018年度基本科研業務青年教師項目（2018-JYBZZ-JS145）——通竅活血湯對顱腦損傷后患者神經功能恢復及神經因子含量的實驗研究

作者簡介：杜勇（1980.06—），男，碩士研究生在讀，主治醫師，研究方向：神經外科疾病的中西醫結合診治，E-mail：dy2zsm@sina.com

通信作者：王革生（1967.11—），男，博士，主任醫師，研究方向：神經外科疾病的中西醫結合診治，E-mail：wanggesh@sina.com