基于網絡藥理學分析當歸補血湯治療糖尿病腎臟病的內在機制

艾思南 朱澤兵 鄭慧娟 田蕾 王耀獻 劉偉敬

摘要 目的：基于網絡藥理學探究當歸補血湯治療糖尿病腎臟病的內在可能作用機制。方法：采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）獲得當歸補血湯（由黃芪、當歸組成）主要活性成分和作用靶點信息;利用GeneCards數據庫獲取與糖尿病腎臟病相關的基因靶點，運用Cytoscape 3.7.1軟件構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡，并運用R軟件進行基因富集分析。結果：共獲得當歸補血湯活性成分30個，其中黃芪具有活性成分19個，當歸具有活性成分11個，經篩選得到主要活性成分共19個;收集到藥物與疾病共有靶點基因71個。基因富集分析結果顯示，當歸補血湯主要通過涉及炎癥反應、凋亡-自噬通路、低氧誘導通路等的21條通路改善糖尿病腎病病情。結論：該研究基于網絡藥理學方法，揭示了當歸補血湯從炎癥反應、自噬-凋亡通路、低氧誘導通路等途徑多成分、多靶點、多通路改善糖尿病腎臟病的作用，為后續研究開展實驗工作提供了更豐富的信息和依據。

關鍵詞 當歸補血湯;黃芪;當歸;糖尿病腎臟病;網絡藥理學

Exploring Mechanism of Danggui Buxue Formula Against DKD Based on Network Pharmacology

AI Sinan1，2， ZHU Zebing1， ZHENG Huijuan1， TIAN Lei1， WANG Yaoxian1， LIU Weijing1

（1 Renal Research Institution of Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，

Beijing 100700， China; 2 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract Objective：To explore the potential possible mechanism of treatment of Diabetic Kidney Disease （DKD） by Danggui Buxue Decoction based on network pharmacology analysis. Methods：The TCMSP platform was used to collect information of the main active ingredients and targets of Danggui Buxue Decoction “Radix Astragali seu Hedysari”and “Radix Angelicae Sinensis”; the gene targets of DKD were obtained from the GeneCards database. Cytoscape 3.7.1 was used to build a drug-active ingredient-target-disease network and R software was used for gene enrichment analysis. Results：A total of 30 active ingredients of Danggui Buxue Decoction were obtained; Among them， Radix Astragali seu Hedysari had 19 active components， Radix Angelicae Sinensis had 11 active components， and 19 main active components were obtained by screening. 71 target genes shared by drugs and diseases were collected. Gene enrichment analysis showed that Danggui Buxue Decoction improves diabetic nephropathy through 21 pathways involving inflammatory response， apoptosis-autophagy pathway， hypoxic induction pathway， etc. Conclusion：Based on the network pharmacological method， this study revealed the multi-component， multi-target and multi-pathway effects of Danggui Buxue Decoction on the improvement of diabetic kidney disease through inflammatory response， autophagy-apoptosis pathway， hypoxia induction pathway and other pathways， providing more abundant information and basis for the subsequent experimental work.

Keywords Dangguibuxue Decoction; Radix Astragali seu Hedysari; Radix Angelicae Sinensis; DKD; Network pharmacology

中圖分類號：R285.6文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.008

隨著人們生活水平的提高和生活飲食習慣的變化，糖尿病作為一種慢性非傳染性的疾病，已經迅速地在全球蔓延開來。國際糖尿病聯盟（International Diabetes Federation，IDF）發布的第九版全球糖尿病地圖中顯示，截至2019年，在20～79歲的人群中，共有約4.63億糖尿病患者。其中中國糖尿病患者數排名第一，總人數約為1.164億人[1]。糖尿病腎臟病（Diabetic Kidney Disease，DKD）是糖尿病導致的以微血管病變為主要特點的腎臟結構和功能的改變，是糖尿病常見且嚴重的并發癥之一。現代醫學尚無針對DKD的特效治療方法，迫切需要利用中醫藥優勢探索有效的治療方法來延遲甚至逆轉DKD的發生和發展。有證據表明中醫藥在改善DKD患者的臨床癥狀和影響實驗室指標方面優于一般療法，并且在安全性方面罕有不良反應報道。具備多靶點、多途徑作用特點的中藥無疑值得進一步深入研究。

國醫大師呂仁和教授提出“腎絡癥瘕”學說，認為糖尿病的病理基礎是熱傷氣陰，進一步發展為氣虛血瘀，瘀阻腎絡，最終形成腎絡癥瘕[2]。氣虛血瘀為消渴病腎病病理過程中重要因素，貫穿于本病始終。當歸補血湯由中藥黃芪和當歸組成，出自李杲的《內外傷辨惑論》卷中：“治肌熱，燥熱，口渴引飲，目赤面紅，晝夜不息，其脈洪大而虛，重按全無。”是補氣生血的經典名方。其中黃芪、當歸藥對按照5∶1組方。方中黃芪補氣健脾，以資氣血生化之源，取“有形之血，不能自生，生于無形之氣”之意。當歸甘溫質潤，補血活血，養血和營。兩藥合用，益氣生血，益氣為主，補血次之，氣血雙補，氣旺而血生。當歸補血湯的化學主要成分為皂苷類、黃酮類、揮發油等[3]。現代藥理研究表明，當歸補血湯具有調節免疫、治療血液病和抗腫瘤等作用[4]。臨床研究表明當歸補血湯治療糖尿病腎病具有多方面的作用，如朱正新等[5]證實當歸補血湯可以通過抑制腎組織TGF-β1的表達，發揮對糖尿病腎病的腎臟保護作用，帥瑜等[6]研究證實當歸補血湯能下調高糖刺激下腎臟組織IRE1α-JNK通路的表達，減輕高糖刺激下腎臟細胞內質網應激，進一步保護腎臟組織，王秀萍等[7]當歸補血湯可有效減少DN大鼠腎臟核因子κB、MCP-1的表達及活性，抑制腎臟炎癥反應，減輕腎臟損傷。由此可見當歸補血湯對于糖尿病腎病的調控是通過多組分、多靶點協同作用而發揮作用。

中藥復方具有化學成分多樣、調控機制復雜的特點，通過網絡藥理學技術，篩選出當歸補血湯主要化學活性成分，探索其治療DKD的相關靶點和通路，為后續開展當歸補血湯治療DKD的作用機制的實驗工作提供了更豐富的信息和依據。

1 資料與方法

1.1 當歸補血湯活性成分的收集和篩選

基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“黃芪”和“當歸”為關鍵詞檢索當歸補血湯所有化合物組分。按照生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug-Likeness，DL）≥0.18的篩選條件選取出當歸補血湯主要活性成分[8-9]。

1.2 當歸補血湯作用靶點的獲取和成分-靶點網絡的構建

利用TCMSP獲取篩選后的當歸補血湯活性成分的作用靶點。利用UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）對上述靶點信息進行規范化處理，限定物種為人（Homo Sapiens），查找蛋白質的名稱，通過基因名稱-ID配對獲取唯一的UniProt ID[10]。

1.3 DKD相關靶點的獲取和疾病-靶點網絡的構建

采用GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）收集與DKD相關的靶點，在UniProt數據庫中通過基因名稱-ID配對獲取上述靶點對應的UniProt ID。并運用Cytoscape軟件構建DKD的疾病-靶點網絡[11]。

1.4 成分靶點與疾病靶點共同靶點的獲取

通過R軟件中的Venn數據包將成分靶點與疾病靶點取交集得到共同靶點，這些共同靶點可能是當歸補血湯治療DKD的關鍵靶點[12]。

1.5 藥物-活性成分-靶點-疾病的網絡構建

運用Cytoscape軟件構建藥物-活性成分-靶點-疾病可視化網絡圖[13]。將獲得的藥物、藥物的成分、關鍵的靶基因、疾病及它們之間的相互對應關系導入Cytoscape，通過Cytoscape插件Network Analyzer計算網絡中節點的拓撲學特征，包括自由度（Degree）、介數（Betweenness）和中心性（Closeness）等，其中自由度值是較為重要的評價指標[14]。

1.6 蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-Protein interaction，PPI）網絡

通過公用數據庫STRING（http：//string-db.org）構建當歸補血湯治療糖尿病腎病關鍵PPI網絡[15]。將物種設置為人（Homo Sapiens），最低閾值設置為0.400，其他參數默認。通過網站在線分析得到PPI圖，將文件導入R軟件，根據代碼腳本計算每一個蛋白相應的拓撲參數值，根據每一蛋白的拓撲參數值排序篩選PPI網絡中核心的靶蛋白。

1.7 關鍵靶點的富集分析

通過R語言軟件包ClusterProfiler進行富集分析，采取超幾何分布檢驗。通過基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析篩選出相關的生物學過程和信號通路[16]。

2 結果

2.1 篩選當歸補血湯主要活性成分和靶點

共獲得當歸補血湯共有212個成分，其中87個屬于黃芪，125個屬于當歸，通過OB值和DL值的篩選，得到黃芪主要活性成分20個，主要活性成分2個。中藥中某些成分具有較好的藥性，但是因為其口服生物利用度低或類藥性差，容易被篩選過濾掉。因此，在相關文獻研究的基礎上，將黃芪皂苷I、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅳ、芒柄花苷以及毛蕊異黃酮苷加入到黃芪的活性成分中，阿魏酸和藁本內酯加入到當歸的活性成分中，共納入黃芪26個成分，當歸4個[17-18]。通過TCMSP獲取以上30個主要活性成分的相關靶點，導入UniProt經過配對后獲得對應的ID并去除重復的靶點，獲得100個相關靶點。在Cytoscape軟件中構建這30個主要活性成分和100個靶點的“活性成分-靶點”網絡。

2.2 獲取與篩選當歸補血湯治療DKD靶點

通過檢索GeneCards數據庫獲取3 645個與DKD相關的靶點基因。在UniProt數據庫中通過基因名稱-ID配對并去除重復后得到3 574個基因名稱。通過R軟件中的Venn數據包將成分100個靶點基因與疾病3 574個靶點基因取交集，獲得71個當歸補血湯治療DKD的作用靶點。見圖1。

2.3 構建藥物-活性成分-靶點-疾病網絡

運用Cytoscape 3.7.1軟件構建當歸補血湯治療DKD藥物-活性成分-靶點-疾病網絡可視化圖，經Network Analyzer分析，篩選出主要當歸補血湯主要成分18個，有12個化合物無對應靶點，靶基因71個。網絡具有91個節點（71個為靶點節點，18個為成分節點，1個為疾病，1個為藥物），248條邊（成分-靶點159條，藥物-成分18條，疾病-靶點71條）。從藥物的成分看，靶點數量最多的槲皮素（Quercetin）有62個，其次為山柰酚（Kaempferol）有25個潛在靶點，異鼠李素（Isorhamnetin）11個，7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）8個，豆甾醇（Stigmasterol）9個，芒柄花素（Formononetin）7個等。從關鍵基因看，PTGS1基因受到15個活性成分的調控，NCOA2 13個，PPARG 11個，AR 9個，ESR1 8個，PGR 7個。見表1。當歸補血湯可能通過作用于這些靶點從而達到治療DKD的作用。見圖2。

2.4 構建PPI網絡

得到當歸補血湯治療DKD的靶標蛋白共661個，每個靶標有對應的關聯度。見圖3。獲取其中關聯度最高的前30個蛋白，其中涉及糖尿病相關靶標蛋白有IL-6、CAPS3、EGFR、VEGF-A、MAPK8、MYC、RELA、HIF-A、NOS3、ICAM1、NF-KB1A、VCAM1等。以橫坐標為關聯度，縱坐標為靶蛋白，得到關鍵蛋白柱形圖。見圖4。

2.5 關鍵靶點的富集分析

將當歸補血湯治療DKD的71個作用靶點基因導入R軟件，并引用Colorspace，Stringi，以及Bioconductor庫中的DOSE，ClusterProfiler，Pathview語言包進行富集分析，具體GO富集分析顯示P<0.05的結果共79條，涉及DNA結合轉錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、近端啟動子序列特異性DNA結合、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結合等。見圖5。其中P值由小到大排列，排名前20條富集結果見表2。KEGG通路富集分析提示P<0.05的信號通路共176條。見圖6。在相關文獻檢索基礎上，除外一些細胞中固有通路及腫瘤相關通路，其中與DKD相關的通路前21條，主要涉及炎癥過程、氧氣調節和凋亡-自噬調節。見表3。

3 討論

當歸補血湯由黃芪和當歸組成，主要作用為“補氣生血”，現代醫家應用于治療多個系統疾病，臨床上也是治療DKD的常見組方。在本研究中，我們通過網絡藥理學分析，確定了當歸補血湯（黃芪、當歸）對應30個關鍵活性組分。這30個關鍵成分可能作用于DKD的71個靶基因，通過PPI網絡分析發現IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA、MAPK8、MYC、ESR1、CCND1、FOS、ERBB2、AR、PPARG、P65、CASP8、PGR、HIF等屬于PPI網絡的中樞蛋白，可能發揮了關鍵的作用。此外，通過GO和KEGG富集，發現流體剪切應力與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE、細胞凋亡、TNF、P53、MAPK、HIF-1、內分泌抵抗、PI3K-AKT、凋亡-多種、細胞衰老、IL-17、松弛素、核因子κB、Th17細胞分化、Ras、EGFR酪氨酸激酶抑制劑受體、ErbB、VEGF、Toll樣受體、胰島素抵抗、T細胞受體、甲狀旁腺激素、2型糖尿病、Th1和Th2細胞分化、JAK-STAT、自噬-動物、線粒體-動物、AMPK等信號通路在其中發揮了至關重要的作用，主要涉及炎癥、氧調節和凋亡調節等生物學過程。

從“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡可以看出，當歸補血湯中的槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、異鼠李素（Isorhamnetin）作用靶點數目最多，說明了這幾個化合物發揮了主要的作用。據報道，槲皮素通過減少細胞內ROS的產生和線粒體功能障礙從而降低氧化應激并且通過減少IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥介質產生從而發揮抗炎作用[19]。山梨醇通過減輕LPS的毒性作用，抑制了ERK、P38和JNK途徑，抑制炎癥介質核因子κB的激活，黏附分子的表達從而發揮其抗炎作用。另有相關研究表明，異鼠李素明顯降低TNF-α、IL-1β和IL-6濃度，抑制核因子κB信號激活。由此可見，當歸補血湯的活性成分從多角度發揮治療DKD作用[20]。

根據富集的結果，我們將從涉及炎癥反應、自噬-凋亡通路和低氧誘導通路3個方面分析當歸補血湯治療DKD的作用機制。

在糖尿病腎臟中，高糖、糖基化終產物（AGEs）和氧化應激激活各種信號傳導級聯反應，誘導炎性細胞浸潤、炎癥介質表達增加，以促進炎癥介質在糖尿病患者中促進腎臟損害。AGEs結合AGE受體（RAGE）激活一系列信號通路，包括MAPK、JAK/STAT、Caspase-3/7等通路，進一步產生黏附分子和炎癥介質、加強炎癥反應，促進DKD炎癥的進展[21]。絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）可以激活核因子κB從而導致炎癥基因的表達增加，核因子κB的下游靶點包括IL-6、TNF-α、MCP1等黏附分子和炎癥介質，這些因子均促進DKD的發展[22]。TNF-α是非常重要的炎癥介質，在DKD模型的腎小球和近端腎小管上皮細胞TNF的表達水平升高。JAK-STAT信號在腎細胞中也起著關鍵作用。研究表明，在DKD患者的腎臟組織中，高血糖狀態引起的系膜細胞、足細胞和腎小管上皮細胞ROS激活，從而導致JAK-STAT信號被激活，從而減輕內皮細胞的炎癥反應[23]。此外，VCAM1和ICAM1的循環水平與DKD進展獨立相關，另外T細胞在細胞黏附分子ICAM-1作用下進入腎內皮細胞，上皮細胞，和系膜細胞等促進炎癥反應的發生[24]。

自噬是一種生理反應，通過溶酶體和自噬小體的結合降解多余蛋白質、有缺陷的細胞器和可溶性分子[25]。在饑餓、衰老、細胞生長控制、腫瘤抑制、缺氧、能量消耗等條件下，通過氨基酸和必需細胞代謝物的循環以保持細胞能量和物質的供應從而使細胞成活。凋亡是細胞程序性死亡的過程，半胱氨酸蛋白酶Caspase家族是細胞凋亡的主要調節因子[26]。自噬和凋亡密切相關，自噬不足和自噬過度都會導致細胞的凋亡，細胞內溶酶體降解過程在DKD足細胞穩態中起關鍵作用。自噬作用在維持溶酶體的均勻性和阻斷自噬誘導作用中也起著關鍵作用，若自噬不足可導致大量的溶酶體積聚，進一步導致DKD中足細胞凋亡[27]。另有研究表明，溶酶體功能激活自噬可能有助于DKD新的治療策略的發展[28]。

近年的研究表明，低氧誘導因子通路在DKD的發生發展中至關重要。在正常細胞內，低氧誘導因子不斷被表達和降解[29]。在正常氧氣濃度情況下，氧氣進入組織細胞，和低氧誘導因子結合使其羥化，低氧誘導因子羥化酶可以識別和氧結合后的低氧誘導因子，從而使其降解。在低氧濃度下，低氧誘導因子無法正常羥化，從而不能使低氧誘導因子羥化酶識別，從而不能被降解。研究表明，2型糖尿病大鼠近端腎小管細胞HIF-1α表達增加[30]，DKD患者的腎組織高血糖引起腎小球高濾過，通過SGLT增加腎小管鈉和葡萄糖的再吸收，從而提高鈉鉀ATP酶的活性，從而增加氧耗[31]。另外腎臟自身存在一種抗氧化防御機制以維持輸送到腎實質的氧氣的恒定，因此糖尿病腎近端腎小管細胞處于慢性缺氧狀態，低氧誘導因子（HIF-1a）在組織內含量上升[32-33]。分別通過靶向誘導VEGF-A促進組織內血管形成。但是，VEGF-A也會通過激活酪氨酸激酶受體調節血管內皮細胞的增殖和遷移，增強血管通透性，從而導致早期超濾，是DKD蛋白尿的形成原因之一[34]。另外，腎小管細胞缺氧狀態可使腎小管上皮細胞HIF-1α的穩定表達導致腎小管間質纖維化引起糖尿病腎纖維化[35]。

中藥復方由具有多成分、多靶點的特點，中藥活性成分對于疾病靶點的調控可能存在相互作用，因此中藥復方治療疾病的作用機制難以闡明。網絡藥理學是通過相關數據庫查找中藥活性成分、成分靶點、疾病靶點，進一步構建網絡，系統地展示藥物和疾病之間的相互作用關系，進一步挖掘中藥復方治療疾病的作用機制。我們運用網絡藥理學的技術，探索當歸補血湯治療DKD的作用機制，可以為今后相關的實驗研究提供了一定的思路。

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（2020-07-28收稿 責任編輯：魏慶雙，徐穎）

基金項目：國家自然科學基金項目（81774278）;國家自然科學基金項目（81774298）

作者簡介：艾思南（1995.02—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中醫藥防治腎臟病，E-mail：aisinan223@163.com

通信作者：王耀獻（1966.02—），男，博士，主任醫師，研究方向：中醫藥防治腎臟病，E-mail：wyx3203@sina.com;劉偉敬（1977.02—），男，博士，主任醫師，研究方向：中西醫結合治療腎臟病及糖尿病，E-mail：liuweijing-1977@hotmail.com