羊棲菜多糖提取條件優(yōu)化

冉宇晴， 陸海濱， 姚湛江， 高麗， 南春容， 金月玲

(溫州醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

羊棲菜(Sargassumfusiforme)又名海大麥、鹿角尖等，隸屬褐藻門圓子綱墨角藻目馬尾藻科馬尾藻屬，是藥食兩用的大型海藻，素有“長壽菜”之美譽(yù)[1-2]。羊棲菜主要生長于太平洋西北部，在我國北至遼東半島南至廣東雷州半島的沿海區(qū)域以及日本和朝鮮南岸均有分布[3]。目前，羊棲菜在浙江溫州洞頭海區(qū)有大量的人工養(yǎng)殖，是一種重要的出口創(chuàng)匯海藻資源。羊棲菜含有豐富的多糖、粗纖維、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，羊棲菜多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[4-5]。

本試驗(yàn)以羊棲菜為原料，通過單因素試驗(yàn)研究料液比、Na2CO3濃度、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)羊棲菜多糖提取工藝的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝并確定最佳條件，旨在為羊棲菜多糖資源深度開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

羊棲菜采自溫州洞頭，洗凈、去除雜質(zhì)后于60 ℃烘箱中干燥至恒重，研碎過40目篩，裝袋備用；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無水Na2CO3粉末，均為分析純。

DGG-9070B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、TDL-80-2B低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、TGL-16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、家用粉碎機(jī)、DK-booB電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海恒科學(xué)儀器有限公司)、722s可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器制造)。

1.2 方法

以苯酚-硫酸法測(cè)定羊棲菜提取液中多糖含量[6]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取濃度為0.1 g·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于6支具塞試管中，加入蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL硫酸，靜置10 min。振蕩搖勻，30 ℃水浴反應(yīng)20 min，于490 nm測(cè)吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.84C+0.007 7，R2=0.998 2。

多糖含量的測(cè)定：取稀釋后的濾液1.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL硫酸，靜置10 min。振蕩搖勻，30 ℃水浴反應(yīng)20 min，于490 nm測(cè)吸光度。將吸光度換算成濃度，計(jì)算多糖得率。

1.2.1 料液比對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取羊棲菜粉末5份，每份10.0 g，設(shè)定Na2CO3濃度為2.0%，水浴溫度為80 ℃，提取時(shí)間為3 h，在料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶80的條件下熱水浴提取2次，計(jì)算多糖得率。

1.2.2 Na2CO3濃度對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取羊棲菜粉末8份，每份10.0 g，固定水浴溫度為80 ℃，提取時(shí)間為3 h，根據(jù)試驗(yàn)1.2.1節(jié)結(jié)果，料液比為1∶30，在Na2CO3濃度分別為0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的條件下熱水浴提取2次，計(jì)算多糖得率。

1.2.3 提取時(shí)間對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取羊棲菜粉末10.0 g，根據(jù)試驗(yàn)1.2.2節(jié)的結(jié)果，在Na2CO3濃度為1.0%，提取溫度為80 ℃，料液比為1∶30的條件下進(jìn)行熱水浴提取，在提取時(shí)間分別為0.5、1、2、3、4和5 h時(shí)，取提取液計(jì)算多糖得率。

1.2.4 提取溫度對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取羊棲菜粉末3份，每份10.0 g，根據(jù)前面試驗(yàn)的結(jié)果，將Na2CO3濃度設(shè)為1.0%，提取時(shí)間設(shè)為3 h，料液比設(shè)為1∶30，在提取溫度分別為65、80和95 ℃的條件下熱水浴提取2次，計(jì)算多糖得率。

1.2.5 羊棲菜多糖正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、Na2CO3濃度、提取溫度及提取時(shí)間為考察對(duì)象，以總糖得率為指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝條件。

1.2.6 浸提次數(shù)對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取羊棲菜粉末2份，每份10.0 g，分別編號(hào)為A、B，在Na2CO3濃度為1.0%、提取溫度為95 ℃、提取時(shí)間為3 h、料液比為1∶30的條件下，熱水浴提取3次，分別計(jì)算多糖得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，料液比低于1∶30時(shí)提取液過于黏稠而無法分離濾液，故試驗(yàn)設(shè)計(jì)料液比最低為1∶30。料液比為1∶30時(shí)多糖得率最高，第一次提取為17.1%，第二次提取多糖得率為8.5%，總糖得率為25.6%。隨料液比增加，多糖得率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)料液比增加到1∶40時(shí)，2次提取的多糖總得率下降為21.0%(圖1)。

圖1 料液比對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

2.2 Na2CO3濃度對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

在Na2CO3濃度為0～1.0%時(shí)，羊棲菜總糖得率隨著Na2CO3濃度的增加而迅速提高。當(dāng)Na2CO3濃度達(dá)到1.0%時(shí)，第一次提取多糖得率為19.3%，第二次提取為5.5%，總糖得率達(dá)24.8%。Na2CO3濃度為1.0%～4.0%時(shí)，總糖得率基本維持不變(圖2)。

圖2 Na2CO3濃度對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

2.3 提取時(shí)間對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

隨著提取時(shí)間的增加，羊棲菜多糖得率呈上升趨勢(shì)。2 h內(nèi)多糖得率迅速上升，2 h后得率升高的趨勢(shì)趨于平緩，提取時(shí)間達(dá)3 h后得率基本不再增加。本試驗(yàn)條件下提取時(shí)間3 h時(shí)多糖得率最高，為11.4%(圖3)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

2.4 提取溫度對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

隨著提取溫度的升高，羊棲菜總糖得率明顯增加(圖4)。在提取溫度為65、80和95 ℃時(shí)，第一次提取的多糖得率分別為10.95%、11.35%和16.63%；第二次提取得率分別為9.37%、12.80%和10.24%，總糖得率分別為20.3%、24.4%和26.9%。可見羊棲菜多糖提取率隨著提取溫度的升高而增加。

圖4 提取溫度對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

2.5 羊棲菜多糖提取正交試驗(yàn)

由表1可知，影響多糖得率的因素由大到小依次排列為C>B>D>A，即Na2CO3濃度>提取時(shí)間>料液比>提取溫度，同時(shí)可知各因素的優(yōu)化工藝參數(shù)為A3B3C2D1。即提取溫度為95 ℃，提取時(shí)間為3 h，Na2CO3濃度為1.0%，料液比為1∶30。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，最佳工藝條件下多糖單次得率為16.6%，此結(jié)果與試驗(yàn)1.2.4結(jié)果一致。

表1 熱水浴堿解提取羊棲菜多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 浸提次數(shù)對(duì)羊棲菜多糖得率的影響

在本試驗(yàn)最優(yōu)提取條件下，第一次提取多糖的平均得率為17.1%，第二次提取為8.5%，第三次提取為2.8%，3次提取得率比為6∶3∶1(表2)。受植物體內(nèi)多糖含量的影響，浸提到達(dá)一定次數(shù)時(shí)，其多糖的濃度會(huì)到達(dá)一個(gè)極限[7-8]。綜合來看，進(jìn)行2次浸提就已經(jīng)能提取出絕大部分多糖，考慮到人力物力條件，進(jìn)行2次提取較為適宜。

表2 不同浸提次數(shù)的羊棲菜多糖得率

3 小結(jié)

不同提取方法和工藝對(duì)植物多糖提取效果具有顯著差異。王凌云[3]在80 ℃、加水量50倍、pH值為5的酸性條件下提取5 h，羊棲菜多糖得率為10.9%。寧亞靜[9]在85 ℃、料液比分別為1∶30和1∶20的條件下，進(jìn)行2次時(shí)間為3 h和2 h的熱水提取，羊棲菜多糖最高得率為20.4%。其試驗(yàn)方法與本試驗(yàn)相似，但設(shè)定的提取溫度比本試驗(yàn)最佳提取溫度低，多糖得率也比本試驗(yàn)低，說明本試驗(yàn)的提取條件具有一定的優(yōu)越性。丁浩淼等[10]采用循環(huán)超聲法提取羊棲菜多糖，得率為10.5%。宋偉康等[11]根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察液料比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)工藝條件，確定了超聲波輔助稀堿提取葉托馬尾藻多糖的最佳工藝參數(shù)為液料比48.56∶1、提取時(shí)間5.78 h、提取溫度70.91 ℃。與本試驗(yàn)確定的最佳提取條件相比，其最佳工藝條件數(shù)值較低，可能是因?yàn)橛谐暡ǖ妮o助。本試驗(yàn)采用熱水浸提法提取羊棲菜多糖，所得多糖提取液以苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量，此方法所需儀器、藥品價(jià)格低廉，操作方便，通過精密度、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果可以看出此方法適合羊棲菜多糖的提取。

試驗(yàn)結(jié)果表明，影響羊棲菜多糖得率的因素由大到小依次排列為Na2CO3濃度>提取時(shí)間>料液比>提取溫度；羊棲菜多糖最佳提取工藝條件為：料液比1∶30、Na2CO3濃度1.0%、提取溫度95 ℃、提取時(shí)間3 h、浸提次數(shù)2次，其多糖得率為25.6%。