產(chǎn)嗜鐵素菌株HZ-2的鑒定及其產(chǎn)嗜鐵素能力的檢測

梁建根

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

鐵對于生命有機體來說是一種必需元素，在生物的代謝過程中起著重要作用。在微生物的代謝過程中，鐵同樣是必不可少的[1]，并且在一些寄主與細菌的相互作用中起著重要作用[2]。在微生物細胞中，鐵是多種酶的輔基或激活劑，在其運輸過程和氧化還原反應中發(fā)揮著重要的作用[3]。此外，對于在有氧條件下生長的微生物而言，鐵是必需的，例如在ATP合成中的氧化還原、DNA前體的還原、血紅素的形成都需要鐵的參與[4]。此外，細胞反應中的氧化-還原過程中細胞色素形成，過氧化物酶、非鐵固氮酶和核糖核苷酸還原酶的活性都與鐵存在著緊密的關(guān)系[5]。

細胞最佳生長所需要的鐵離子(Fe3+)濃度至少為1 mmol·L-1[4]，雖然鐵元素在地殼中的含量為第4位，但在自然環(huán)境中，F(xiàn)e2+易被氧化成Fe3+，所以在自然的pH下鐵元素多以氧化鐵和氫氧化鐵這2種不可溶的、非常穩(wěn)定的多聚體形式(10～18 μm)存在于環(huán)境中，難以被生物利用[4,6-7]。但生物體通過不斷的進化，利用各種機制在低鐵的環(huán)境中去獲取Fe3+，其中分泌嗜鐵素(siderophores)獲取Fe3+的途徑最為常見[6,8]。這種特殊的鐵螯合劑通過對難溶性鐵的活化、吸收和運輸來提供微生物本身對鐵營養(yǎng)的需求[9]。隨著不同嗜鐵素的發(fā)現(xiàn)，人們對其研究興趣日益加強，細菌、真菌、植物和藻類在缺鐵的條件下均能產(chǎn)生嗜鐵素。目前，大約有500多種嗜鐵素已經(jīng)被定性分析，其中研究比較多的是微生物產(chǎn)生的嗜鐵素。而且各種類型的嗜鐵素有非常大的差異，一般可以分成三大類，其功能既是一種生長或萌發(fā)的促進因子，也是一種毒力因子[10]。目前，國內(nèi)學者報道了嗜鐵素對植物種子萌發(fā)有促進作用[11-13]。

本文對從土壤中分離的假單胞菌菌株HZ-2的具體分類地位和其產(chǎn)生嗜鐵素能力進行了系統(tǒng)全面的研究，為以后開發(fā)和應用嗜鐵素類微生物代謝奠定基礎(chǔ)，而菌株HZ-2所產(chǎn)生的嗜鐵素有望成為一種新型的微生物農(nóng)藥制劑。

1 材料與方法

1.1 菌株

實驗用的菌株假單胞菌菌株HZ-2是一株土壤根圍植物有益細菌，從浙江杭州的番茄根際分離所得，分離、培養(yǎng)和純化使用金氏培養(yǎng)基。保存在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)(5 g牛肉提取物，10 g蛋白胨，5 g NaCl，20 g大米，1 000 mL H2O，pH 7.0～7.2)中，儲存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 培養(yǎng)基

實驗過程中用到的培養(yǎng)基有PDA培養(yǎng)基、KMB培養(yǎng)基、肉汁胨培養(yǎng)基(固定和液體)、Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)基、琥珀酸培養(yǎng)基等[14-15]。

1.3 菌株HZ-2的鑒定

1.3.1 菌落培養(yǎng)性狀與菌體形態(tài)特征觀察

將在KM培養(yǎng)基上分離純化后的菌株接種在NA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)和顏色等特征[15-16]，并挑取培養(yǎng)24 h后的新鮮菌體進行革蘭氏染色[17]，在透射電鏡下觀察菌體形態(tài)和鞭毛的著生情況。

1.3.2 菌株生理生化指標的測定

將菌株HZ-2活化后，依據(jù)參考文獻[15,18]進行反硝化等生理與生化指標的測定。

1.3.3 菌株HZ-2的脂肪酸分析

參照MIDI公司的操作手冊，將菌株HZ-2在NA培養(yǎng)基上活化，接種于Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取菌，經(jīng)過甲基化等處理后提取脂肪酸進行氣相色譜分析，最后使用美國MIDI公司開發(fā)的專業(yè)全自動微生物鑒定軟件對菌株HZ-2進行脂肪酸組成分析。鑒定結(jié)果要結(jié)合菌株的培養(yǎng)特征、最高相似度SI(similarity index)的菌種名稱等因素來決定最后的菌株命名。

1.3.4 菌株HZ-2的16S rDNA序列分析

實驗首先要做得是提前設(shè)計好引物，將引物設(shè)計好后對菌株HZ-2的16S rDNA進行擴增[19-20]，PCR的擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳檢測，回收目標DNA片段并測序，序列進行同源性比對后來確定菌株HZ-2的分類地位。

1.4 菌株HZ-2所產(chǎn)嗜鐵素的檢測

1.4.1 通用CAS平板檢測

CAS檢測液的制備。將6 mL 10 mmol·L-1十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)置于100 mL容量瓶中，并用雙蒸水適當稀釋，將1.5 mL 1 mmol·L-1FeCl3·6H2O和7.5 mL 2 mmol·L-1CAS溶液混合，沿玻璃棒慢慢加入容量瓶中。將4.3 g無水哌嗪溶于水中并加入6.25 mL 12 mol·L-1鹽酸，獲得pH 5.6的緩沖液，然后將此溶液轉(zhuǎn)入前述的容量瓶中，并用雙蒸水定容至100 mL，121 ℃ 15 min滅菌后備用[21]。

CAS檢測平板的制備。將配制好的1 mol·L-1CaCl2溶液、1 mmol·L-1MgSO4·6H2O溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液121 ℃ 15 min單獨滅菌后備用。分別取0.2 mL的CaCl2溶液、0.2 mL的MgSO4·7H2O溶液、6 mL 10%的酸水解酪蛋白溶液，加入生物緩沖溶液Pipes，調(diào)pH值至6.8～7.0。去離子水定容至100 mL，加入2 g瓊脂粉，121 ℃ 15 min滅菌后，溫度降至60 ℃時，加入5 mL已經(jīng)配置好的CAS藍色檢測液，混合均勻。注意不要產(chǎn)生氣泡，影響平板檢測實驗。然后按照每皿25 mL傾注于培養(yǎng)皿中。陽性反應通過CAS顏色從藍色變?yōu)辄S色或橙色來記錄。記錄CAS瓊脂平板在菌落周圍形成暈圈。

1.4.2 嗜鐵素的定量檢測

無鐵培養(yǎng)基采用琥珀酸培養(yǎng)液，富鐵培養(yǎng)基在無鐵培養(yǎng)基中加入FeSO4·7H2O至濃度為100 μmol·L-1(可抑制嗜鐵素的產(chǎn)生)。2種培養(yǎng)基分裝到150 mL的三角瓶中，每瓶50 mL，121 ℃ 15 min滅菌后備用。實驗中使用的所有玻璃容器都需要浸泡在6 mol·L-1HCl中過夜，并多次用蒸餾水沖洗，以除去殘留鐵的痕跡[22]。

嗜鐵素發(fā)酵液的制備。菌株HZ-2的菌體在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)活化后，從NB平板菌種刮取一環(huán)菌體接種于上述裝有50 mL 2種培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，180 r·min-128 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，再以10%(V/V)的接種量接種到裝有50 mL培養(yǎng)基的體積為300 mL的三角瓶中，200 r·min-128 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，以獲得最大產(chǎn)量的嗜鐵素。發(fā)酵液于4 ℃ 10 000 r·min-1離心15 min，即獲嗜鐵素發(fā)酵上清液及其對照(無嗜鐵素)，用于后續(xù)嗜鐵素定量測定。

取上述已經(jīng)制備好的嗜鐵素發(fā)酵上清液與等體積CAS檢測液，反應達到平衡后，測定630 nm波長處的吸光度值(A)，同法測定對照液的吸光度值(Ar)，用A/Ar值來定量菌株HZ-2分泌嗜鐵素的能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HZ-2的菌落形態(tài)與菌體特征

菌株HZ-2在NA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后觀察到菌落呈扁平圓形，邊緣齊整，略呈黃色，菌落表面濕潤，較黏并呈半透明狀，有凸面隆。透射電鏡下，菌體呈長桿狀，大小0.7～1.1 μm×2.0～4.0 μm，鞭毛單端叢生(圖1)，能運動。革蘭氏染色呈陰性，無芽孢和莢膜。

圖1 菌株HZ-2鞭毛著生情況

2.2 菌株HZ-2的生理生化特征

依據(jù)細菌鑒定手冊[15-16]，實驗菌株的測定結(jié)果如表1，結(jié)合形態(tài)學特征，可將菌株HZ-初步鑒定為惡臭假單孢菌(Pseudomonasputida)。

表1 產(chǎn)嗜鐵素菌株HZ-2的生理生化特征

2.3 菌株HZ-2的脂肪酸分析

依照MIDI系統(tǒng)鑒定標準操作手冊，當相似系數(shù)SI值大于0.5，而且第一匹配值和第二匹配值相差大于0.1時，認為鑒定成功，所參試的菌株可以鑒定為第一匹配值所呼應的菌名。本試驗的結(jié)果表明第一選擇SI值0.761，而且第一匹配值和第二匹配值相差大于0.1。因此，可以將菌株HZ-2鑒定為表2中第一匹配值對應的菌名惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。

2.4 菌株HZ-2的16S rDNA序列分析

以菌株HZ-2的基因組DNA為模板，PCR擴增后電泳檢測得到一條大小約1.5 kb的特異性條帶(圖2)，與已報道的序列長度相吻合[20,23-24]。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcolⅠ和PstⅠ雙酶切后電泳檢測，同樣得到大小約為1.5 kb 左右的片段(圖3)，這表明菌株HZ-2的16S rDNA片段已經(jīng)成功克隆到pGEM-T Vector中。測定克隆質(zhì)粒的16S rDNA基因全序列，用軟件錄入，轉(zhuǎn)化為GenBank信息庫形式。BLAST同源序列檢索結(jié)果表明，菌株HZ-2與GenBank收錄的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)基因序列相似性最高，達到99%。結(jié)合本試驗中結(jié)果可將菌株HZ-2鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。

圖2 菌株HZ-2的PCR產(chǎn)物

圖3 菌株HZ-2的重組質(zhì)粒EcolⅠ和PstⅠ雙酶切產(chǎn)物

2.5 嗜鐵素的定性檢測

挑取單個菌落在通用CAS平板上點種，以大腸埃希菌HB101作為對照菌株，如圖4所示，由于大腸埃希菌HB101菌株的嗜鐵素合成基因(entE)沒有缺失，但是培養(yǎng)10 h內(nèi)，菌株HZ-2菌落b處產(chǎn)生了明顯的橙紅色暈圈，隨著培養(yǎng)時間的延長，橙紅色暈圈逐漸變大，經(jīng)多次傳代，其嗜鐵素產(chǎn)生能力沒有變化。而大腸埃希菌HB101菌落a處沒有暈圈產(chǎn)生，證明了菌株HZ-2能夠產(chǎn)生嗜鐵素，而且產(chǎn)嗜鐵素能力很強并且很快。

A—大腸桿菌HB101；b—菌株HZ-2。圖4 菌株HZ-2的CAS平板檢測

2.6 嗜鐵素的定量檢測

菌株HZ-2產(chǎn)嗜鐵素的A值為0.067，Ar值為1.353，A/Ar值為0.049。參照嗜鐵素合成能力標準[25]可以斷定，HZ-2產(chǎn)嗜鐵素的能力屬于極強范圍。

3 討論

近年來微生物鑒定自動化系統(tǒng)的開發(fā)和運用以其快速準確的優(yōu)點得到了廣泛關(guān)注，本文運用Sherlock MIS微生物鑒定系統(tǒng)，對產(chǎn)嗜鐵素菌株進行了鑒定，與常規(guī)形態(tài)特征觀察、生理生化指標測定結(jié)果以及16S rDNA基因全序列分析結(jié)果相一致，表明脂肪酸(FAME)鑒定法是一種有效的鑒定手段。

嗜鐵素的定量檢測目前一般采用CAS法，該方法以A/Ar的比值大小相對定量微生物分泌嗜鐵素的能力。為確保結(jié)果的準確，實驗需要注意2個環(huán)節(jié)：首先是要把控反應達到平衡的時間點，而一些研究報告[26]忽略了這點，其次是測試中菌懸液的處理問題。本實驗待反應顯色穩(wěn)定后，并采用高速冷凍離心技術(shù)對菌懸液進行了處理，這樣保證了結(jié)果的精確性。